脂肪干细胞向表皮细胞表型转分化的研究

目的探讨脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)跨胚层向表皮细胞表型转分化的可能性。方法取大鼠脂肪组织,用酶消化法分离、培养ADSCs,用免疫细胞化学法、流式细胞仪法鉴定ADSCs。实验分为皮肤匀浆条件培养基诱导7d组;皮肤匀浆条件培养基加入EGF(20ng/ml)诱导7d组;皮肤匀浆条件培养基诱导4d,撤条件培养基,改10?S/DMEM培养3d组;10?S/DMEM为对照组。诱导后经流式细胞仪检测CK19、CK10的表达。结果①免疫细胞化学分析表明ADSCs表达CD49d,而不表达CD106、CD34、CK19、CK10;流式细胞仪检测CD49d、CD44的阳性率分别为94.32%、90.38%。②各诱导实验组细胞CK19阳性率分别为45.32%、26.58%、23.37%,CK10阳性率分别为43.56%、25.54%、18.20%,较对照组CK19阳性率18.53%、CK10阳性率2.46%,明显增高(P<0.01),差异有统计学意义。结论皮肤匀浆液可以诱导ADSCs向表皮细胞表型转分化。     

人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究

目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法。方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红O染色鉴定。实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pc DNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的Ha Cat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs加入10%FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量。结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义。结论:转染EGF的Ha Cat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

吸脂组织中脂肪干细胞分离和定向分化的研究

目的探讨吸脂组织中的干细胞分离和体外诱导分化为表皮样细胞、成骨细胞及脂肪细胞的可能性。方法通过电动负压吸引获取1例行吸脂手术的30岁女性腹部脂肪组织,酶消化法获取脂肪来源干细胞,体外培养扩增,通过流式细胞仪检测表面抗原的表达。取生长良好的第3代人脂肪来源干细胞,分别应用成表皮诱导培养液（70％培养液A＋30％成纤维细胞培养基上清液＋10ng／L表皮生长因子）,成骨诱导培养基（DMEM／10％FBS,0．1μmol／L地塞米松,50μmol／L维生素C,10mmol／Lβ-甘油磷酸钠,100U／ml青霉素,100U／ml链霉素）和成脂肪细胞诱导培养基（DMEM＋10％FBS＋500μmol／L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤＋1μmol／L吲哚美辛）诱导20d后,分别对成表皮诱导组进行免疫组化检测CK19表达,成骨诱导组进行碱性磷酸酶检测,成脂诱导组进行油红O检测。结果流式细胞仪鉴定结果示,人脂肪来源干细胞CD44和CD49d为阳性,CD34为阴性。诱导20d后,成表皮诱导组示免疫组织化学鉴定结构显示有CK19的表达;成骨诱导组示细胞碱性磷酸酶染色阳性;成脂肪细胞诱导组示油红O染色,胞质内脂滴均被染成红色,证实为脂性液体。结论从吸出的脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞,在体外进行了脂肪干细胞的扩增和传代,所分离的脂肪来源干细胞具备多向分化能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞的实验观察

目的:研究表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)加条件培养基体外诱导大鼠 MSCs 向表皮细胞定向分化的可行性。方法:采用 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液分离扩增大鼠骨髓 MSCs,免疫细胞化学染色及流式细胞仪进行鉴定。传至第3代的大鼠 MSCs 用表皮生长因子(EGF)、条件培养基等定向诱导 MSCs 分化为表皮细胞;免疫细胞化学对细胞角蛋白 CK5/8、19(Cytokeratin5/8、19)阳性表达细胞进行检测。结果:从大鼠骨髓中分离培养的 MSCs 增殖能力强,细胞表面标志 CD34、CD45阴性,CD29、CD44阳性,流式细胞仪检测显示细胞纯度高,诱导后7d 细胞免疫化学显示角蛋白5/8、19染色阳性,具有表皮细胞特征。结论:从大鼠骨髓中分离培养出的问充质干细胞,具有自我更新和增殖能力强的特点,经诱导可定向分化表达角蛋白。     

脂肪组织中血管基质部分细胞向内皮细胞诱导分化的实验研究

目的探讨脂肪组织中血管基质部分（Stromal vascular fraction。SVF）细胞向内皮细胞诱导分化的方法。方法脂肪抽吸术获取人脂肪组织，消化法得到的细胞接种在FN包被的培养皿内，细胞培养，传至第2代，分诱导组和非诱导组进行培养。免疫细胞荧光分别检测诱导组和非诱导组的vWF表达；流式细胞仪分别检测诱导组和非诱导组的CD34、CD45、CD133和PECAM—1表达率；荧光显微镜观察细胞摄取DiI—ac—LDL的功能。结果诱导组细胞12d后呈现内皮细胞典型的铺路石样形态；免疫细胞荧光显示诱导组vWF表达阳性；荧光显微镜观察显示诱导组细胞具有摄取DiI—ac—LDL的功能；流式细胞仪检测显示诱导组PECAM—1阳性率为（67．41±13．35）％，明显高于非诱导组的（6．73±2．21）％（p〈0．01），非诱导组CD34阳性率（72．39±13．45）％，明显高于诱导组的（16．06±3．861％阳性率（p〈0．01）。结论脂肪组织中血管基质部分细胞能够诱导分化为成熟内皮细胞，有望为血管组织工程提供新的种子细胞来源。     

诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨诱导脂肪干细胞(ADSCs)向血管内皮细胞(ECs)分化的可能性,为ADSCs应用于创伤修复的理论提供实验依据.方法 切取大鼠脂肪组织,用酶消化法分离、培养ADSCs,流式细胞仪检测第3代ADSCs的CD49d和CD106的表达以鉴定ADSCs.实验组用含30%大鼠血管匀浆液的条件培养液诱导大鼠ADSCs,空白对照组用含10%胎牛血清DMEM培养液培养大鼠ADSCs,各组诱导3 d后经免疫组化和流式细胞仪检测ADSCs中CD34和血管性假血友病因子(vWF)相关抗原的表达变化.结果 流式细胞仪检测ADSCs的CD49d和CD106阳性率分别为(98.32±0.37)%和(1.67±0.61)%;血管条件培养液诱导组细胞CD34和vWF阳性率分别为(77.14±0.76)%和(75.46±0.37)%,较空白对照组(1.38±0.31)%和(1.70±0.23)%均升高,差异有统计学意义(P<0.01).结论 ADSCs可以被诱导向ECs表型分化,提示ADSCs具有参与创伤后血管形成的潜能,可以应用于创伤修复的治疗.     

脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化后的表型变化

目的：比较人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向汗腺样细胞诱导前后表型特征的变化.方法：对hUC-MSCs进行分离、培养、鉴定,通过显微镜观察、免疫细胞化学、流式细胞术等方法比较hUC-MSCs经汗腺分化诱导培养液培养前后细胞形态变化及癌胚抗原（CEA）、角蛋白7（CK7）、CK8、CK14、CK18、CK19表达的差异.结果：hUC-MSCs向汗腺样细胞诱导前呈梭形,呈成纤维细胞样;流式细胞仪检测发现CD29、CD90表达阳性;而CD34、CEA、CK14、CK19表达阴性.经汗腺诱导培养基诱导后hUC-MSCs分化为外形肥大、不规则、类似铺路石样的细胞,聚集性增殖;免疫细胞化学检测显示CK7、CK8、CK18抗原表达阳性;流式细胞仪检测结果显示CEA、CK14、CK19的阳性表达率分别为77.98%,48.47%,20.85%.结论：hUC-MSCs经过汗腺分化诱导培养基培养后能够分化为表达汗腺细胞标记物抗原的汗腺样细胞.     

脂肪干细胞原代培养及其向表皮细胞诱导分化的研究

目的 探讨人脂肪干细胞(adipose-derivedstem cells,ADSCs)体外原代培养方法及诱导分化为表皮细胞的可能性.方法 利用酶消化法原代培养ADSCs,免疫细胞化学检测其相关表面抗原CD29、CD34、CD44、CD49d、CD80、CD106的表达;用表皮细胞诱导培养基对ADSCs进行体外诱导,观察细胞的生长情况及形态变化;对诱导前后两种细胞行细胞增殖活性及细胞角蛋白表达检测.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,且能稳定传代;免疫组织化学染色证实有特定的干细胞表面标记物表达;对ADSCs成功进行了体外诱导培养,其细胞形态及蛋白表达均有向表皮细胞分化的倾向,并且仍具较高增殖活性.结论 利用酶消化法可在体外成功培养ADSCs,并能持续传代;ADSCs表达特定的干细胞表面抗原;ADSCs可成功进行体外诱导,有向上皮细胞分化的倾向.     

去分化来源表皮干细胞与在体表皮干细胞之间的差异分析

目的：比较去分化来源的表皮于细胞与在体表皮干细胞之间的异同点。方法：采用碱性成纤维细胞诱导因子（bFGF）诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞;由人包皮分离、培养在体表皮干细胞。采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、细胞染色体核型检测技术及逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）观察去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞之间细胞表面标志蛋白表达、细胞亚群及染色体核型等方面的差异。结果：免疫细胞化学染色结果表明,去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如融整合素、角蛋白19（CK19）、CK14等,而CK10的表达为阴性。流式细胞技术检测结果显示去分化来源的表皮干细胞及在体表皮干细胞中α6^＋CD71^-、α6^＋CD71^＋及CD71表达阳性的细胞亚群分别占被检测细胞总数的22．8％、68．14％、0及45．39％、33．11％、0．02％。细胞染色体核型检测分析结果显示去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞的染色体均为23对、46条,核型正常。此外,RT-PCR检测结果表明去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞中融整合素、CK19、CK14及CK10的mRNA表达水平差异无显著性。结论：去分化来源的表皮干细胞和在体表皮干细胞之间存在着细胞亚群的分布差异,提示其具有更强的增殖能力;二者在细胞核型和表面标志蛋白表达等方面具有相似性。去分化来源的表皮干细胞可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化

目的 观察不同条件下骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导分化为肾小管上皮样细胞的差异。 方法 抽取SD大鼠的骨髓,经密度梯度离心分离,联合贴壁筛选法获取纯化的MSC。以流式细胞仪鉴定间充质干细胞表面标志。取扩增3代的MSC分组培养：（1）对照组：用含胎牛血清培养基;（2）全反式维甲酸（ATRA）组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA;（3）联合诱导组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA+表皮生长因子（EGF）+骨形成蛋白（BMP-7）。诱导7 d后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;化学染色检测细胞碱性磷酸酶表达;免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18（cytokeratin-18）、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。 结果 流式细胞仪显示,体外分离培养的第3代MSC,CD44阳性细胞表达率为97.8%±0.9%;CD90阳性细胞表达率为96.8%±1.4%;CD29阳性细胞表达率为97.6%±2.4%;而CD11b/c阳性细胞表达率为13.2%±0.6%; CD34阳性细胞表达率为1.2%±0.5%。诱导7 d后,与对照组长梭形细胞相比,ATRA组部分细胞为圆形、短梭形单层排列;联合诱导组的大部分细胞为圆形、短梭形,细胞密集处呈鹅卵石样排列。碱性磷酸酶染色显示,对照组细胞为阴性;ATRA组部分细胞阳性;联合诱导组阳性细胞数明显增多。免疫细胞化学显示,ATRA组和联合诱导组细胞cytokeratin-18阳性表达率分别为29.47%±1.08%和47.52%±2.13%,显著高于对照组（P ＜ 0.05）;E-cadherin阳性表达率分别为14.88%±2.46%和36.15%±1.13%,也显著高于对照组（P ＜ 0.05）。 结论 在体外模拟的急性肾衰竭微环境中加入ATRA可诱导MSC部分分化为肾小管上皮样细胞。联合EGF、BMP-7共同诱导能进一步促进MSC向肾小管上皮样细胞分化。     

与人汗腺细胞共培养的人骨髓间充质干细胞表型转化中细胞外信号调节激酶通路的作用

目的观察人骨髓间充质干细胞(MSC)与热休克的人汗腺细胞(SGC)间接共培养后,其表型转化情况及细胞外信号调节激酶(ERK)通路所起的作用。方法体外分离和培养人MSC、SGC,采用二步免疫细胞化学法鉴定其均为纯化的SGC、MSC。将原代培养的SGC于47℃下行热休克处理后收集上清液。将第3代MSC作为实验对象并分组。对照组:行常规培养;SGC上清液组:采用含体积分数30％SGC上清液、体积分数1％胎牛血清、1×105U／L青霉素和0．1 g／L硫酸链霉素的DMEM／F12培养基培养;SGC上清液+表皮生长因子(EGF)组、SGC上清液+PD98059组同SGC上清液组处理后,分别添加50μg／L EGF、10μmol／L PD98059继续培养。培养7 d时用流式细胞术检测各组细胞中细胞角蛋白(CK)7、癌胚抗原(CEA)的阳性表达率,以蛋白质印迹法检测ERK和磷酸化ERK(pERK)的表达水平。结果SGC上清液组CK7、CEA阳性表达率分别为(5.76±0．10)％、(2．01±0．09)％;SGC上清液+EGF组分别为(7．31±0.21)％、(7．27+0.12)％;SGC上清液+ PD98059组分别为(1．63±0．11)％、(1．54±0．07)％。与对照组比较,前两组两项指标均明显升高(P<0.01),后一组却与之相近。各组细胞均表达ERK;但pERK水平以SGC上清液+EGF组最高,其次为SGC上清液组,SGC上清液+PD98059组和对照组几乎无表达。结论人MSC、SGC间接共培养可诱导MSC表型转化,ERK通路参与该过程并起着积极作用。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的：探索高效分离和扩增人脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs）的方法,观察其生物学特性,并通过形态学、免疫表型及多向分化能力进行鉴定。方法：以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,体外扩增后传代,倒置显微镜观察,MTT比色法测定细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达。在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、IBMX、吲哚美辛的诱导下向脂肪细胞定向分化;在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、胰岛素的诱导下向成骨细胞定向分化。结果：原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好。细胞传代后2天内处于潜伏期,第3天进入生长期,5天后进入平台期。流式细胞仪检测CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105阳性率分别为73.4%、3.6%、4.5%、2.0%、97.3%、80.4%。经定向诱导分化后,细胞分别呈现脂肪细胞、骨细胞的表型特征。结论：酶消化法能有效分离纯化人ADSCs,细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有ADSCs的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向汗腺细胞分化及其信号通路研究

目的 观察人脐带间充质干细胞(UCMSC)向汗腺细胞(SGC)分化的能力以及细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在分化过程中的作用。 方法 (1)体外分离培养UCMSC和SGC,通过检测CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、细胞角蛋白7(CK7)、CK19、癌胚抗原(CEA)表达情况鉴定UCMSC,检测CK19、CEA表达情况鉴定SGC。(2)制作热损伤SGC模型,按随机数字表法将铺于Transwell培养板下层的UCMSC分为4组,均用汗腺培养液培养：对照组,培养液中不添加刺激因素;热损伤组,将热损伤SGC（每孔1×104个）接种于Transwell培养板小室与UCMSC间接共培养;热损伤+ EGF组,在热损伤组处理条件基础上,培养液中添加50 ng/mL EGF;热损伤+PD98059组,在热损伤组处理条件基础上,培养液中添加10 nmol/mL ERK信号通路特异性抑制剂PD98059。1周后,流式细胞仪检测各组UCMSC中CK7、CK19表达率,免疫组织化学法检测CK19、CEA表达情况并计算CEA表达率,蛋白质印迹法检测磷酸化ERK (pERK)表达水平。对数据行多组间单因素方差分析。 结果 (1) UCMSC高表达CD29、CD44、CD105,少量表达或不表达CD14、CD34、CD45、CK7、CK19、CEA;SGC中CEA和CK19均呈阳性表达,证实获得的2种细胞均为纯化细胞。(2)诱导培养1周后,热损伤组与热损伤+ EGF组UCMSC中CK7、CK19、CEA阳性表达率及pERK表达水平分别为(6.4±0.7)％、(5.7±0.3)％、(7.4±1.0)％、0.790±0.049与(14.3±1.0)％、(12.6±1.1)％、(17.6±2.3)％、1.200±0.032,均显著高于对照组的(2.2±1.5)％、（2.2±0.7）％、(3.3±0.7)％、0.640±0.026,F值分别为78.49、139.36、87.13、191.74,P值均小于0.01;热损伤+EGF组UCMSC 各指标水平显著高于热损伤组（F值为50.14～145.47,P值均小于0.01）;热损伤+PD98059组与对照组UCMSC各指标水平相近（F值为0.00～0.13,P值均大于0.05）。 结论 UCMSC在热损伤SGC的微环境中能够分化为SGC,ERK通路参与了UCMSC向汗腺细胞分化的过程。     

无血清培养条件下人表皮干细胞的生物学特性研究

目的建立人表皮干细胞的无血清培养法并观察其生物学特性。方法从幼儿包皮中分离表皮细胞,用Ⅳ型胶原纯化表皮干细胞,分别在常规(血清组)、无血清(无血清1组)和无血清但添加牛垂体提取物(无血清2组)条件下进行培养。20d后观察比较3组细胞形态学变化、克隆计数、传代计数、α6及CD71表达情况,并进行细胞周期分析,检测细胞角蛋白(CK)19、CK5/8、CK10的阳性细胞百分比。结果无血清1组与血清组细胞形态相近,均可形成43个左右克隆,可传代10次,α6briCD71dim细胞百分比为(48±6)%,(72.7±6.2)%的细胞处于G0/G1期,CK19、CK5/8、CK10表达情况与血清组相近,差异无统计学意义(P>0.05)。无血清2组除细胞克隆数、CK10阳性细胞百分比高于前两组外(P<0.05),其他检测指标均偏低(P<0.05)。结论无血清培养基能选择性培养人表皮干细胞,这一模型可用于进行表皮干细胞生物学特性的相关研究。     

Choukroun’SPRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun＇s PRF（Choukroun＇s platelct-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs,采用Choukroun法制备自体PRF备用,观察细胞生长情况。取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。将第3代ADSCs分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养,观察细胞生长情况,培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不合PRF的普通培养基（空白组）进行培养,第7天、14天、21天、28天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测;诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形,向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性,流式检测鉴定CD29、CD90为阳性,CD45为阴性。CCK-8法示PRF组Ⅰ的0D值均大于对照组Ⅰ,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。ALP活性检测示PRF组Ⅱ第7天、14天、21天、28天细胞活性较对照组Ⅱ均大,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。PRF组Ⅱ成骨诱导7天后vonKossa染色阳性;14天后阳性细胞增多,对照组Ⅱ诱导7天未见钙结节,14天见少量阳性钙结节,空白组培养14天未见黑色钙结节。结论：Choukroun’sPRF明显促进脂肪干细胞增殖及成骨分化,为骨组织工程提供了新的技术。PRF与干细胞共同培养可能还有许多潜在的临床及生物工程应用价值,值得进一步研究。