氮源对蛹虫草生长及类胡萝卜素产生的影响

【背景】蛹虫草是一种珍稀食药用菌,类胡萝卜素不仅为其重要活性成分,而且影响子实体的外观品相,但是类胡萝卜素产生的影响因素不明。【目的】揭示氮源对蛹虫草生长和类胡萝卜素产生的影响。【方法】测定不同氮源培养基中菌株生长速度、分生孢子产生及类胡萝卜含量,筛选菌株生长的最适氮源,进一步研究不同浓度的氮源对蛹虫草生长及类胡萝卜素产生的影响,并测定不同光照条件下氮源浓度对蛹虫草子实体类胡萝卜素产生的影响。【结果】蛹虫草在不同的氮源培养基中菌落形态和类胡萝卜素产生存在明显差异。麦麸和黄豆粉培养基中菌株生长速度最快,但是菌落稀疏,正面分别呈现荧光黄色和极微弱红色;蛋白胨和酵母提取物培养基中菌落致密,产孢量极显著高于其它氮源培养基(P0.01),菌落正面为橙黄色;甘氨酸和柠檬酸为氮源时完全没有色素产生,其它无机和氨基酸氮源培养基平板背面有微量色素产生。固体和液体静置培养条件下均发现蛋白胨浓度在0-3%的范围内,随着浓度的增加,类胡萝卜素含量增加;子实体栽培中不同的氮源浓度均表现为蓝光光照条件下类胡萝卜素含量显著高于白光;而在白光和蓝光光照条件下均表现为蛋白胨浓度为1%时类胡萝卜素含量最高,分别为2 809.38±386.24μg/g和4 093.75±518.37μg/g。【结论】氮源种类和浓度显著影响蛹虫草类胡萝卜素的产生,蓝光光照和1%蛋白胨浓度为子实体类胡萝卜素产生的最佳条件,这为栽培富含类胡萝卜素的蛹虫草子实体提供了试验依据。     

不同来源的蛹虫草子实体活性成分的比较

通过比较不同来源的蛹虫草子实体的活性成分以探讨蛹虫草品质的差异。对17个蛹虫草菌株栽培得到的子实体及16个市售样品中的多糖、核苷类成分、游离糖醇及小分子糖类的含量进行分析测定,并比较其核苷类成分HPLC指纹图谱。结果表明,因菌株不同蛹虫草子实体的活性成分具有不同程度的差异,菌株对虫草素含量的影响最大,其次是N ⁶-(2-羟乙基)腺苷,因菌株不同虫草素含量可相差14倍,N ⁶-(2-羟乙基)腺苷的含量差异可达6倍以上。市售样品中的核苷类成分分析结果也证明了在测定的几种成分中,虫草素是含量差异最大的活性成分。17个蛹虫草菌株子实体的多糖含量为1.81%-4.92%,甘露醇含量为1.44%-4.47%,海藻糖含量为3.58%-25.43%。16个市售样品的多糖含量为2.84%-5.55%,甘露醇含量为0.96%-3.93%,海藻糖含量为1.04%-19.91%。采用数据归一化法进行子实体品质综合评价研究,结果表明菌株G7a、G10a、G15a综合品质较好,多数成分含量均大于平均值,是生产高品质蛹虫草的合适菌株。     

蛹虫草优良菌株的筛选

通过对5株蛹虫草的菌丝形态和生长速率、液体培养生物量和胞外多糖、人工栽培和子实体中活性物质虫草多糖和虫草素的对比研究,筛选出优良的蛹虫草菌株。试验结果表明：蛹虫草6号菌株的菌丝的生长速率比其他菌株快;液体培养生物量和胞外多糖含量明显高于其他菌株;人工栽培的蛹虫草子实体头部大,子囊壳丰富,颜色橘黄,出草整齐均匀,出草率高,子实体中虫草多糖和虫草素的含量均高于其他菌株,表明6号菌株具有较高的经济价值,是值得开发和推广的好品种。     

2株北虫草菌株系统发育及其活性成分含量分析

对收集的2株北虫草菌株进行形态学观察、分子鉴定及子实体中主要活性成分含量分析,为其应用研究提供技术支持。采用平板培养法、玻片培养法及显微观察对2株北虫草菌株进行形态学观察;基于ITS序列分析对2株实验菌株进行分子鉴定;有效成分的测定均采用高效液相色谱法。结果表明,2株北虫草子实体形态及在PDA加富培养基上菌丝长势、菌落形态差异显著,ITS序列分析结果显示,2株北虫草为蛹虫草,属种内差异;二者腺苷成分相近,但尖头北虫草虫草素的含量是大孢子头北虫草的2倍,且同一品种不同栽培方法及同一种源不同栽培地获得的子实体中两种活性成分的含量有所不同,尤其是腺苷的含量差异明显。以北虫草子实体的品相作为品质优劣的评估标准缺乏科学依据,在子实体应用过程中应根据需要科学选择。     

蛹虫草的光形态建成及蓝光受体基因Cmwc-1

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link],隶属于肉座菌目(Hypocreales),麦角菌科(Clavicipitaceae),虫草属(Cordyceps),其滋补作用和药用功效与名贵但难以人工培养的冬虫夏草相近,并日渐成为冬虫夏草的理想替代品。蛹虫草为虫草属模式种,分布广泛,在人工培养基或昆虫蛹体上能产生无性和有性阶段,其基因组已公布,成为大型真菌生物学研究的理想模型。对真菌而言,光可影响其生长发育、生理周期、形态变化及次级代谢产物产生,光照是蛹虫草子实体生长发育的必要条件,并能够调控其类胡萝卜素的产生。该研究采用5株代表性的蛹虫草菌株,包括1株退化菌株、1株白化菌株和3株在栽培中广泛运用但子实体形态各异的菌株作为对象,研究其光形态建成、克隆蓝光受体基因Cmwc-1并测定在不同光照条件下其表达量的变化。结果表明,除白化菌株外,光照刺激促进菌丝色素的形成,且蓝光的作用优于白光。光照抑制生长速度,所有的菌株在黑暗条件下生长最快,白光次之,蓝光最慢,退化菌株的生长速度在3种培养条件下均优于其他菌株。此外,光照促进分生孢子的产生。退化菌株在白光和蓝光条件下产孢量均最大。为了从分子层面阐明蛹虫草对光刺激的应答反应,该研究通过Hai-l tail PCR和基因步移的方法克隆得到了蓝光受体基因Cmwc-1。CmWC-1是1个GA-TA-Zinc finger型转录因子,含有谷氨酸富集结构域,LOV(Light,Oxygen,or Voltage),PAS(Per-Arn-t Sim)和锌指结构域,与粗糙脉孢霉的蓝光受体结构域组成基本一致。对5个研究对象的CmWC-1序列比较分析发现3个菌株在谷氨酰胺富集结构域缺失5个谷氨酰胺。基于JTT模型的贝叶斯树和最大似然法构建的WC-1系统树,其树形和ITS序列构建的系统树基本一致,且粪壳菌纲的一些主要类群以较高的支持率被划分为单系,说明WC-1可以作为系统进化分析的一个参照。Cmwc-1在黑暗条件下表达,光照刺激后表达量增加,待光照时间持续30 min,其表达量将不再上升,即光适应现象。蛹虫草光受体基因的研究将为子实体发育研究奠定基础。     

蛹虫草表型多态性对子实体产生及虫草菌素的影响

为选育高产子实体和虫草菌素的蛹虫草菌株,从野生蛹虫草中分离单孢子并进行分型,之后进行产子实体实验;同时对蛹虫草子实体进行了产孢结构的观察,并用高效液相色谱仪检测了子实体和培养基中的虫草菌素。结果表明,菌落背面颜色为橙铬色的菌株容易产生子实体;出发(原代)菌株所产子实体在形态上更接近野生蛹虫草,而角变株的子实体畸形;出发菌株产子实体能力要比该菌株未发生角变部分分离株和角变部分分离株都强。在虫草菌素的产量上也以出发菌株为高,表明表型多态性对蛹虫草产子实体和虫草菌素有很大的影响。这对于优势菌种的筛选和生产实践有借鉴意义。     

互补交配型配对诱导蛹虫草有性子实体形成

前期我们获得了优良性状蛹虫草Cordyceps militaris野生菌株W141436,其子实体虫草素含量高达3.72 mg/kg干重,子实体多糖高达6.7 g/100 g干重,但在大规模应用中发现它发生退化。针对蛹虫草人工栽培退化问题,我们提出蛹虫草子实体形成是有性生殖过程,其两种交配型发生交配是蛹虫草子实体形成的必要条件。本文基于交配型基因分子标记研究了优良性状蛹虫草野生菌株W141436的退化机制。具体地,采用单孢子分离的方法对蛹虫草野生分离株W141436的子囊孢子进行分离,得到了72个单孢菌株。进一步采用PCR方法对单孢菌株及亲本菌株进行了交配型基因类型鉴定。在72个单孢菌株中,28株为Mat1-1类型交配基因型,31株为Mat1-2类型交配基因型,13株含有与亲本相同的交配型基因。根据鉴定结果,对2株Mat1-1型(SP28、SP33)和2株Mat1-2型(SP15、SP32)菌株进行了栽培实验。结果表明,形成子实体的栽培用亲本菌株同时含有Mat1-1和Mat1-2两种交配类型基因,即只有含不同交配型基因的菌株具有发育为子实体的能力,而含同种交配型基因的菌株则不能发育为子实体。本研究为防止蛹虫草在大规模种植中退化提供了理论依据。     

培养基和栽培方式对蛹虫草子实体活性成分的影响

采用麦粒（W）、麦粒加蚕蛹粉（WW）、大米（R）、大米加蚕蛹粉（RW）的配料栽培方式,以及蚕蛹（CY）活体接种栽培方式培养蛹虫草子实体,比较蛹虫草子实体中多糖及核苷、游离糖醇和小分子糖类含量。结果表明：培养基和栽培方式影响蛹虫草多糖含量及其单糖组成和分子量分布,多糖含量最高的为蚕蛹活体接种培养的处理（CY）,多糖含量为6.19%,其他处理的多糖含量仅为CY的44.4%-62.8%;蚕蛹（CY）上培养的蛹虫草子实体中核苷类成分含量最高,在麦粒上培养获得的子实体中核苷含量显著高于在大米上的处理,并且麦粒添加蚕蛹粉后培养的子实体中尿苷、鸟苷、N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量显著上升,大米添加蚕蛹粉后培养的子实体中尿苷、虫草素、N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量显著上升;配料栽培的4个处理,其子实体中海藻糖含量为20.07%-23.40%,蚕蛹活体接种的处理（CY）海藻糖含量显著降低,为8.41%;添加蚕蛹粉后子实体中甘露醇含量显著降低。对各成分含量的数据进行归一化处理后进行蛹虫草品质的综合评价,在蚕蛹上培养的蛹虫草综合评分最高,麦粒为主要培养基培养的蛹虫草品质好于大米为主要培养基的,且添加蚕蛹粉的处理优于未添加的处理。     

影响虫草子实体生长的因素探讨

人工培养虫草子实体是确证虫草无性型的有力证据,讨论了生态环境对天然虫草的影响,并对人工培养虫草子实体的影响因素如营养、温度、温度、通气、光照、菌株等进行了探讨。     

四种子囊菌甲醇提取物的抗氧化活性研究

比较了冬虫夏草Cordyceps sinensis、古尼虫草Cordyceps gunnii、蛹虫草Cordyceps militaris、黑柄炭角菌Xylaria nigripes等四种子囊菌提取物的抗氧化活性,对它们的子实体(F)和菌丝体(M)甲醇提取物清除DPPH自由基能力、还原力、金属离子鳌合能力和总酚含量进行了测定,结果显示四种子囊菌子实体的自由基清除能力、还原力和总酚含量均高于其菌丝体(P0.05),但四种子囊菌子实体的DPPH清除能力不存在显著差异(P0.05);古尼虫草和蛹虫草子实体的还原力和总酚含量显著高于冬虫夏草和黑柄炭角菌子实体(P0.05),但前两者之间不存在显著差异(P0.05)。总酚含量和DPPH自由基清除能力、还原力呈正相关。     

蛹虫草蓝光诱导两步法发酵产类胡萝卜素

采用黑暗摇瓶发酵和蓝光照射静置培养的两步培养法,进行蛹虫草(Cordyceps militaris L.)液体发酵产类胡萝卜素的蓝光诱导。结果表明蛹虫草在2d的黑暗培养和5d的蓝光照射静置培养后,其类胡萝卜素的含量可达到最高值558.4μg/gFW。而以黑暗摇瓶培养2d后,进行不同时间的蓝光照射静置培养。结果表明,蓝光照射最初2d,蛹虫草类胡萝卜素含量变化不明显,随后快速增加,并在第5天达到最大值558.4μg/gFW,随后类胡萝卜素的含量并无明显变化。通过研究解决了蛹虫草液体发酵产类胡萝卜素的培养过程中蓝光的给光问题。     

不同光质补光对火龙果茎生理特性及开花结果的影响

为探究不同光质补光对火龙果茎生理特性的影响,该文采用红光、白光、蓝光3种不同光质对火龙果进行夜间补光,测定火龙果茎中可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素、线粒体蛋白、线粒体膜电位及细胞分裂素(CTK)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)3种内源激素的含量,并统计茎长、开花数、果实产量相关指标.结果表明:3种光质补光均可提高火龙...     

拟南芥野生型与隐花素突变体光调节的蛋白质鉴定与聚类分析

光是控制植物生长发育十分重要的环境因子之一.隐花素是植物的蓝光受体,在植 物中调节多种光形态建成,包括抑制下胚轴的伸长、子叶的伸展和调节植物的开花时间 等,但隐花素依赖蓝光调节光形态建成的分子机制尚不清楚.本文采用比较蛋白质组学 方法研究了在持续蓝光和红光下生长的拟南芥隐花素双突变体cry1cry2和野生型幼苗的全蛋白图谱.采用基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)进行肽质谱指纹图谱分析.在cry1cry2和野生型中鉴定了71个差异蛋白点.这些差异蛋白质反应光的变化可以形成6类,结果表明,光调节隐花素是通过控制许多相关基因的表达而实现的,为进一步研究拟南芥隐花素的光反应机制提供一些有用的信息.研究表明,蛋白质表达图谱可用于研究各种突变体在不同光照条件下光应答之间的关系.     

不同光质LED光源对草莓光合特性、产量及品质的影响

以‘妙香7号’草莓品种为材料,利用LED精量调制光源,设红光、蓝光、黄光、白光、红/蓝/黄(7/2/1)、红/蓝(7/2) 5个处理,以白光为对照,测定了草莓叶片的光合与荧光参数、色素含量、果实产量、品质和根系活力指标,研究 500 μmol·m^-2·s^-1光强下不同光质处理对草莓光合特性、果实产量及品质的影响.结果表明： 红光处理有利于提高草莓叶片的净光合速率与蒸腾速率,而蓝光有减弱作用;气孔导度与胞间CO₂浓度均以蓝光处理效果最为显著.叶绿素荧光参数(F_o、F_m、Φ_PSⅡ)均在红光处理下最大,而F_v/F_m、F_v/F_o、F_m/F_o均在红/蓝/黄处理下最大;红/蓝/黄处理下草莓色素含量、果实产量和根系活力均显著高于其他处理.红光处理的可溶性固形物和维生素C含量均最高,且与红/蓝/黄处理差异不显著;蓝光处理有利于提高可滴定酸和蛋白质含量,而红/蓝/黄处理的固酸比最大.红/蓝/黄处理最有利于增加光合色素含量,提高果实产量,促进部分品质改善.     

耐热木霉菌株筛选及其对热作区香蕉促生效应的研究

【目的】为筛选安全、高效的耐热木霉功能菌株,有效促进热作区香蕉的生产,本研究从热作区土壤分离筛选适温范围较宽的木霉菌株,研制木霉生物有机肥,并研究其对香蕉枯萎病发病率、果实产量及品质的影响。【方法】通过稀释涂布法筛选出木霉菌株,根据菌株在不同温度下的生长情况、拮抗尖孢菌能力及酶活强弱进行菌株复筛;将复筛所得菌株试制成生物有机肥,在田间条件下,研究木霉生物有机肥的施用对香蕉发病率、产量及品质的影响;最后结合菌株ITS及tef1序列分析鉴定所选菌株的分类信息。【结果】从海南土壤中筛选出4株耐热木霉菌株,其在20–40°C能生长,其中菌株JS84在40°C高温下生长速度最快,对尖孢镰刀菌4号生理小种抑制率最高,产酶活力能力最强。田间试验结果表明:施用JS84木霉生物有机肥(JS84)显著降低了香蕉枯萎病发病率;有效改善了香蕉果实品质并提高了土壤养分;该处理产量显著高于不施肥对照、化肥处理、有机肥处理和商品木霉生物有机肥处理(NJAU4742),分别增产32%、18%、8%和6%。ITS结合tef1序列分析结果表明,JS84菌株为桔绿木霉菌(Trichoderma citrinoviride)。【结论】从热作区土壤中成功筛选到一株桔绿木霉JS84,其适宜生长温度宽,研制的木霉生物有机肥对热区香蕉具有显著的抗枯萎病及增产作用。     

Ecophysiological characterization of ammonia-oxidizing archaea and bacteria from freshwater

Aerobic biological ammonia oxidation is carried out by two groups of microorganisms, ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and the recently discovered ammonia-oxidizing archaea (AOA). Here we present a study using cultivation-based methods to investigate the differences in growth of three AOA cultures and one AOB culture enriched from freshwater environments. The strain in the enriched AOA culture belong to thaumarchaeal group I.1a, with the strain in one enrichment culture having the highest identity with "Candidatus Nitrosoarchaeum koreensis" and the strains in the other two representing a new genus of AOA. The AOB strain in the enrichment culture was also obtained from freshwater and had the highest identity to AOB from the Nitrosomonas oligotropha group (Nitrosomonas cluster 6a). We investigated the influence of ammonium, oxygen, pH, and light on the growth of AOA and AOB. The growth rates of the AOB increased with increasing ammonium concentrations, while the growth rates of the AOA decreased slightly. Increasing oxygen concentrations led to an increase in the growth rate of the AOB, while the growth rates of AOA were almost oxygen insensitive. Light exposure (white and blue wavelengths) inhibited the growth of AOA completely, and the AOA did not recover when transferred to the dark. AOB were also inhibited by blue light; however, growth recovered immediately after transfer to the dark. Our results show that the tested AOB have a competitive advantage over the tested AOA under most conditions investigated. Further experiments will elucidate the niches of AOA and AOB in more detail.     

覆土层中细菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响

【目的】筛选对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体生长有促进作用的细菌单菌株,并对其进行鉴定。【方法】将3株细菌菌株C1、T24、T34及引进4株细菌菌株1B00263、1A0081、1A03263、1A01082单菌株添加到覆土层,定期测覆土层菌丝生长长度、原基形成时间、原基数目、子实体成熟数及子实体重。选出对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体生长有促进作用的菌株,并采用分子生物学方法对其进行鉴定。【结果】添加T34菌株的处理在暗褐网柄牛肝菌子实体整个形成过程中起着重要的作用,不仅对覆土层暗褐网柄牛肝菌菌丝生长有显著促进作用,对子实体形成、平均单菇重也有显著促进作用;添加C1、T24、1A01082、1B00263、1A03263单菌株的处理对覆土层暗褐网柄牛肝菌菌丝的生长有显著的促进作用;添加1A00081、1B00263、C1、1A03263单菌株的处理,原基形成时间(19.86 24.14 d)比对照(27.00 d)提前7 3 d,对暗褐网柄牛肝菌原基的形成也有促进作用。C1、T24、T34对暗褐网柄牛肝菌菌丝、子实体的生长起着不同程度的促进作用,这3株细菌经分子生物学鉴定,结果为:C1为短杆菌属(Brevibacterium sp.),T34为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),T24的种属关系还有待进一步确定。【结论】7株细菌单菌株添加到覆土层,研究其对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体生长的影响。最终筛选到一株细菌菌株T34(芽孢杆菌属Bacillus sp.),对暗褐网柄牛肝菌菌丝及子实体的生长均有显著的促进作用。