心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：干细胞具有“环境依赖性分化”特性,以心肌组织裂解液模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究甚少。 目的：观察心肌组织裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的影响。 方法：选用生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,加入诱导液连续培养5周,连续观察细胞形态学特征的变化规律,采用α-Actin进行免疫细胞化学染色观察干细胞是否向肌细胞方向分化,收集诱导后的细胞行苏木精-伊红染色观察是否存在闰盘,并通过电镜观察其超微结构。 结果与结论：加入诱导液后大部分细胞呈“竹节样”,α-Actin免疫细胞化学染色阳性,表明间充质干细胞向肌细胞方向分化;苏木精-伊红染色可见闰盘,透射电镜下见排列整齐明暗相间的肌丝,扫描电镜下可见胞浆内有纤维状结构,说明“竹节样”细胞具有心肌细胞的典型形态结构特点。连续诱导12 d多个区域出现成片的、具有自律性搏动的多核肌管结构。心肌组织裂解液可模拟心肌细胞的微环境,诱导骨髓间充质干细胞分化为具有典型形态结构特征和相应功能活动的心肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞过程中结构蛋白的发育

目的探讨体外经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成心肌样细胞过程中肌联蛋白在心肌结构蛋白发育过程中的作用。方法构建针对Wistar大鼠TITINN2B区设计的重组质粒pSITITIN,将其分别转染入体外培养7d的新生大鼠心肌细胞和经5-aza诱导后2周的MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白、MHC、肌动蛋白、cTnT的表达。结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞后,肌联蛋白的表达减弱(P<0.001);转染入经5-aza处理的MSCs后,肌联蛋白、cTnT的表达减弱,MHC、肌动蛋白的表达无明显变化。结论MSCs可以被5-aza诱导分化成心肌样细胞,但分化程度不高,尚不具备完整的收缩结构基础,肌联蛋白对心肌结构蛋白发育过程有重要的意义。     

微环境对体外间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用

目的研究心肌组织中何种细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞定向分化起决定性作用。方法分离培养骨髓MSCs、心肌细胞(CM)和内皮细胞(EC)。MSCs经BrdU标记后与CM、EC分别共培养和单独培养,通过形态学、免疫细胞化学和双重免疫细胞化学鉴定。结果分离培养的MSCs、CM和EC纯度高于95%。标记MSCs与CM共培养后,细胞具有心肌细胞样形态。4周时,有44%的细胞BrdU与肌动蛋白(sarcomeric actin)或连接蛋白-43(connexin-43)双重免疫细胞化学染色阳性。与EC共培养以及单独培养时,MSCs形态变化不明显,无双染阳性细胞出现。结论CM对骨髓MSCs向心肌样细胞的定向分化具有重要作用。     

心肌梗死大鼠血清促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用

 目的: 探讨急性心肌梗死（AMI）大鼠血清在体外对大鼠骨髓间质干细胞（BMSC）分化为心肌细胞的作用。方法: 将大鼠BMSC分为6组进行细胞培养：Ⅰ组为未诱导组(对照组),Ⅱ组为5-aza诱导组,Ⅲ组为5-aza＋AMI血清诱导组,Ⅳ组为5-aza＋正常大鼠血清诱导组,Ⅴ组为AMI血清诱导组,Ⅵ组为正常大鼠血清诱导组。培养30 d后进行分化细胞鉴定，检测细胞的形态变化和心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌细胞转录因子GATA-4和结蛋白（desmin）的表达。结果: 大鼠BMSC经5-aza或5-aza联合血清诱导后，向心肌样细胞分化，其cTnT、GATA-4、desmin表达阳性。对照组和单纯血清诱导组的BMSC未见形态改变，其cTnT亦为阴性，但GATA-4、desmin却呈弱阳性。另外，5-aza联合血清诱导组在诱导2周后可观察到部分细胞呈缓慢而有节律的跳动，而单纯5-aza诱导组未见细胞跳动。结论: 单纯用AMI大鼠血清不能诱导BMSC向心肌细胞分化，但AMI血清能促进5－aza诱导的BMSC向心肌细胞分化，并促进分化的心肌细胞成熟。     

骨髓间质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为心肌细胞。 方法： 采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs，在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导，用免疫细胞化学和RT-PCR方法对诱导细胞进行鉴定。 结果： 诱导后细胞体积较诱导前增大，而且更加细长，呈长梭形。14 d后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示诱导后部分细胞结蛋白(desmin)、横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)和心肌特异性肌钙蛋白(troponin I)呈阳性反应。RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达。 结论： 5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的用川芎嗪(ligustrazin hydrochloride)在体外定向诱导SD青年鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，rMSCs)分化为神经元样细胞。方法用低糖DMEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，接种在塑料培养瓶中。经体外扩增、纯化，选用第5代后的骨髓间质干细胞进行诱导分化。用10μg／LbFcF预诱导24h，更换成含川芎嗪的无血清培养基DMEM诱导间质干细胞分化为神经元样细胞。用免疫组织化学SABC法鉴定神经丝蛋白(NF—M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果第5代间质干细胞形态达到均一，呈梭形。用川芎嗪诱导15min到3h，间质干细胞胞体逐渐增大，并伸出细长突起形似神经元样细胞。免疫组织化学显示NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43表达阳性，而GFAP阴性。对照组上述染色均为阴性。结论川芎嗪可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的 :探讨体外培养骨髓间充质干细胞的方法以及定向诱导分化成心肌样细胞的条件。方法 :常规骨髓穿刺获取细胞悬液 ,应用Percoll液密度梯度离心以及贴壁培养技术分离间充质干细胞。使用不同浓度的 5 -氮胞苷定向诱导分化 ,应用透射电镜观察细胞超微结构和免疫细胞化学技术检测细胞特异性心肌收缩蛋白、舒张蛋白以及连接蛋白的表达。结果 :在 5 aza诱导后第 2 0天 ,约 3 0 %的细胞表达肌钙蛋白T、α 横纹肌肌动蛋白、肌浆网磷酸受钙蛋白和连接蛋白 43。透射电镜观察 ,胞浆内粗面内质网丰富 ,部分内质网正在合成肌丝。结论 :骨髓间充质干细胞具有分化为心肌样细胞的潜能。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:采用5-氮胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞(M SCs)为心肌样细胞,对比分析诱导细胞与正常心肌细胞表型的差异,从而分析5-aza的诱导效应。方法:分离培养大鼠骨髓M SCs,通过检测不同浓度的5-aza诱导后M SCs表面CD 45、CD 54、CD 90分子的表达并与正常心肌细胞表型进行比较,以观察5-aza对间充质干细胞体外分化诱导的影响和作用。结果:5-氮胞苷能有效地诱导间充质干细胞分化为心肌样细胞,诱导后的细胞表面均表达M H C和desm in分子。浓度为10μm ol/L的5-aza诱导组细胞表型更接近于心肌细胞。结论:M SCs在体外条件下经5-aza诱导可以分化为心肌样细胞,10μm ol/L的诱导浓度为最优浓度。     

利用c-kit~+骨髓间充质干细胞与心脏脱细胞骨架共培育心肌组织

背景:研究发现c-kit阳性骨髓间充质干细胞可特异分化为心肌细胞,可能成为理想的种子细胞。目的:验证利用c-kit+骨髓间充质干细胞及心脏脱细胞骨架培育心肌组织的可行性。方法:取成年大鼠心脏脱细胞后备用。取大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第8代后行c-kit富集,采用5μmol/L的5氮杂胞苷诱导2周后行二氢吡啶受体α2富集,然后继续培养行心肌分化鉴定或种植于心脏脱细胞骨架内行心肌组织培养。6周后,利用心肌细胞特异性蛋白表达及动作电位鉴定心肌细胞分化,利用免疫荧光染色分析新生心肌组织结构。结果与结论:第2次富集6周后,约60%的骨髓间充质干细胞表达心肌肌钙蛋白T、GATA结合蛋白4、连接蛋白43,电生理分析显示这些细胞可产生心肌细胞样动作电位,证实c-kit+骨髓间充质干细胞可特异分化为心肌细胞,种植于脱细胞心脏骨架后可形成排列有序的心肌组织。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的通过体外诱导研究大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用5-氮杂胞苷定向诱导,通过形态学、免疫细胞化学及磷钨酸苏木素染色(PTAH)鉴定。结果诱导后细胞以梭形、柱状为主;部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;诱导24h后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后表达逐渐增强;诱导细胞PTAH阳性。结论骨髓间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰时干细胞移植治疗的理想细胞材料。     

心肌微环境与5-氮杂胞苷诱导脂肪间充质干细胞心肌分化的差异

目的 探讨体内心肌微环境及体外5-氮杂胞苷（5-aza）诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用差异。 方法 取小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞（ADMSCs）,对其进行表面标记和成骨、成脂分化能力鉴定。选取生长状态良好的第3代ADMSCs,分为5-aza体外诱导组、体内心肌移植组,体外诱导3周以及体内移植1周后,采用免疫荧光技术检测特异性心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。 结果 两种诱导方法ADMSCs均表达cTnT,5-aza诱导组3周表达率（33.33±3.79）%,移植组1周表达率（42.93±4.04）%,移植组1周较5-aza诱导组3周具有更高的分化效率（P<0.05）。 结论 体外5-aza化学诱导和体内心肌微环境均可使ADMSCs分化为心肌样细胞,但心肌微环境的诱导分化效率明显高于5-aza的作用。     

应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的 探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征.方法 将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs).将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α一横纹肌肌动蛋白(asarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、a-MHC基因表达,鉴定细胞分化.结果 将5-aza诱导形成的:EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric:actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、αMHC基因.10μmol/L5-aza处理组心肌细胞分化率较高.结论 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关.     

碱性成纤维细胞生长因子和5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞分化潜能和细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和5-氮杂胞苷(5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,在倒置相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期改变;MTT法检测bFGF和5-aga对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测actin、desmin、myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化;MSCs经5-aza以及5-aza加bFGF联合诱导actin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高;而经bFGF诱导后,前4种蛋白表达无明显变化,仅GFAP蛋白表达显著增高。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,而bFGF有明显促增殖作用。MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞,bFGF可使MSCs分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。 目的：以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。 方法：采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。 结果与结论：诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA 4 mRNA表达水平较未诱导组显著增加(P < 0.05)。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

心肌细胞发育及细胞间闰盘样连接形成的扫描电镜观察

本文报告用扫描电镜观察体外培养的人胎儿心肌细胞发育的形态特征。材料来自妊娠10、13、16周人胎儿心脏。首先进行组织块培养,然后观察由培养团块上新生并脱离团块贴璧生长的心肌细胞。培养早期(脱落贴壁生长1周左右),细胞呈球形、短梭形,表面有各种突起。中期(脱落生长约2～4周)细胞呈扁平不规则形。细胞间由突起相连接。晚期(脱落生长超过1个月)部分细胞可发育成带状、柱状,由闰盘样结构连接成分支状。体外培养的胎儿心肌细胞,在发育过程中,可见闰盘样结构形成的过程,通过这种连接,使一群细胞相互连接,平行排列成束,近似于成熟心肌细胞的形态及排列。本文研究提示,体外培养的人胎儿心肌细胞似有分化、发育成熟的趋向。     

丹酚酸B及丹参酮ⅡA诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

背景：目前大多数研究者采用5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞,存在着一定的不良反应,难以应用于临床。中药丹参本身在临床上广泛用于治疗心血管系统疾病,其主要化学成分为丹酚酸 B和丹参酮ⅡA。 目的：观察丹酚酸B及丹参酮ⅡA联合诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞的效果。 方法：取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞,应用丹酚酸B、丹参酮ⅡA及二者联合分别对第2代骨髓间充质干细胞定向诱导,不加诱导剂为空白对照组。3 d后各实验组去除诱导培养基,用正常培养基继续培养4周。 结果与结论：空白对照组细胞结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T及缝隙连接蛋白43均为弱阳性或阴性表达。与空白对照组相比,丹酚酸B组,丹参酮ⅡA组,丹酚酸B+丹参酮ⅡA组骨髓间充质干细胞各标记物阳性表达均明显升高,且差异有显著性意义(P < 0.01)。其中,二者联合诱导组各标记物的阳性率均最高。荧光免疫细胞化学鉴定可见诱导组细胞质内结蛋白的表达呈红色,肌钙蛋白T的表达呈绿色,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。结果显示丹酚酸B及丹参酮ⅡA均可分别诱导骨髓间充质干细胞获得心肌分化表型,且二者联合诱导效果最好。     

大鼠骨髓间质干细胞诱导分化为心肌样细胞膜电流的研究

目的： 研究大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）诱导分化为心肌样细胞膜电流的状态。方法： 按文献方法进行MSCs的诱导培养和鉴定。诱导后培养4周，用全细胞膜片钳技术，检测胞膜电流，并与未经诱导分化的MSCs进行比较。结果： 未经诱导分化的MSCs不表达内向电流，只表达外向钾电流。MSCs经5-aza诱导后表达心肌特异性肌钙蛋白T，记录到2种膜内向电流，分别为钠电流（I_Na）和L-型钙电流（I_Ca），以及3种外向钾电流，包括瞬间外向钾电流（I_to），超快速激活延迟整流钾电流（I_kur）及缓慢激活延迟整流钾电流（I_ks）。与未经诱导分化的MSCs相比，诱导后MSCs的钾电流以I_kur和I_ks为主。结论： 经5-aza诱导后，MSCs可分化成具有电压依赖性内向I_Na、I_Ca和外向I_to、I_kur、I_ks的心肌样细胞。     

放射抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能并导致骨损伤

目的 观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨组织的影响.方法 分离、培养正常的及接受4Gy放射后28d的小鼠BMMSCs,用碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色法鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变,并通过骨组织形态学和骨密度(BMD)检测放射后小鼠体内骨组织的相关变化.结果 4Gy照射28d后小鼠BMMSCs的成骨潜能明显降低,同时体内骨组织结构破坏,小鼠骨密度降低.结论 放射损伤后小鼠BMMSCs的成骨潜能显著降低,可能在干细胞水平参与了放射后骨损伤的发生.     

3种诱导法诱导CD73+脂肪间充质干细胞成心肌细胞效果的比较

目的 从脂肪来源的间充质干细胞（ADMSCs）的混合细胞群中分离纯化出CD73阳性的细胞亚群,证明几种不同诱导法诱导CD73细胞的
成心肌分化潜能。方法 体外分离培养1~3 月龄小鼠的ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73⁺和CD73^-两个细胞亚群。分别培养两组细
胞,利用5-氮杂胞苷（5-aza）、心肌组织裂解液和5-aza+心肌组织裂解液对两组分选出的细胞分别进行成心肌的诱导。利用免疫细胞化学技术
检测3种诱导法的成心肌效果。结果 未分选的ADMSCs可分化为成脂和成骨细胞,分选的CD73⁺细胞具备分化为心肌细胞的良好潜能。3种诱导法
均能诱导CD73⁺ADMSCs向心肌方向分化,5-aza诱导CD73⁺ADMSCs分化为心肌细胞率为（22.99±6.72）%,心肌组织裂解液组心肌细胞率（14.12±5.42）%,5-aza+心肌组织裂解液组心肌细胞率（26.94±6.11）%。3种方法比较,5-aza+心肌组织裂解液的诱导效果最佳（P<0.05）。结论 CD73+比CD73-
的ADMSCs更易于分化为心肌细胞。化学诱导因素和体外模拟心肌微环境,可高效诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌细胞。