免疫球蛋白轻链基因的结构及其表达

对免疫球蛋白(Ig)基因结构的探索,开始于对各种Ig多肽链氨基酸序列资料的分析。1965年Dreyer和Bennett在对K轻链分析的基础上,提出“两个基因、一个多肽”的假说,推测一条轻链是由分开的两个DNA片段——可变区(V)和恒定区(C)基因分别编码的,通过DNA重新排列,V和C基因连接,才表达出一条完整的多肽链。其后对Ig肽链结构和遗传学标志分析的大量资料,支持并发展了这一假说。1970年Gally和Edelman就进一步提出细胞中必定有许多不同的V基因,特定的Ig生成将涉及体     

免疫球蛋白重链可变区基因的结构及表达

在阐明真核基因组结构及功能的研究进程中,免疫球蛋白(Ig)基因十分引人注目,这不仅是由于它的结构比较复杂,而且由于它的表达牵涉体细胞分化过程中特有的DNA重组排列,突出反映了真核基因组织和表达的精巧。对Ig基因已有过不少综述,本文着重归纳重链(H)可变区(V)基因的结构和表达方面研究的进展。胚原型重链可变区基因的结构概貌重链V区(V_H)基因群与其3＇侧下游的恒定区(C_H)基因群相连成重链基因族(gene family),位于小鼠第12号染色体,     

嵌合抗体基因的转染与表达方法初步研究

外源基因导入原核和真核细胞技术是重组DNA在细胞中表达所不可缺少的手段之一。本实验采用已构建的嵌合基因(小鼠Ig可变区基因已连接在人Ig恒定区基因上)pSVΔHgpt17-1A-V_(11)hCr_3(pSVgpt-r_3)和pSV _(134)ΔH meo DNS V_k H_uK(pSV meo-K)(美     

分泌抗单克隆类风湿因子的抗个体型单抗杂交瘤的建立

个体型是指在同一个体内,不同的抗体形成细胞所产生的免疫球蛋白(Ig)有各自不同的抗原特异性,它受各自细胞内基因控制。决定个体型抗原特异性的部位主要在抗体可变区的超可变区,是针对超可变区某些抗原决定簇的抗体。在某种程度上个体型代表与抗原结合的部位,因此抗个体型抗体     

人PD-L1Ig融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获取人PD L1Ig融合蛋白 ,研究其对T细胞的调节效应 ,采用PCR法从pMD18 T/PD L1中扩增出人PD L1基因的胞外段序列 ,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1Fc恒定区基因 ,两者拼接后插入逆转录病毒载体pEGZ Term ,用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染 2 93T包装细胞 ,用含病毒颗粒的培养上清反复感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选能稳定分泌人PD L1Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆之 ,经无血清培养 ,收集的上清用Dotblot检测、ELISA定量后 ,浓缩并经ProteinG柱纯化 ,再经Westernblot鉴定。以FACS分析纯化蛋白对活化T细胞表达的PD 1结合能力 ,以体外T细胞活化体系观察其对T细胞表型的调节作用。结果表明 ,成功地构建了表达人PD L1Ig蛋白的重组逆转录病毒载体 ;获得的L92 9/PD L1Ig细胞能稳定分泌人PD L1Ig蛋白 ;该蛋白与PD 1受体具有良好的结合能力 ,能抑制T细胞的进一步活化。     

抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。     

个体基因型网络学说

免疫系统的基本要素是淋巴细胞和免疫球蛋白(Ig)。人的免疫系统大约是由10~(12)个淋巴细胞和10(20)个抗体分子组成的。V基因决定的抗体分子可变区不仅表现抗体活性,而且显示抗原性。所以说,Ig分子既是抗体又是抗原,既能识别也能被识别。对于Ig可变区表现出的抗原特异性,称为个体基因型(idiotype),对于能够识别该个体基因型的另一Ig可变区的特异性则称为抗个体     

稳定表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞株的建立及其免疫原性分析

目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅡ-Iex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性。方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,得到多个细胞克隆。采用免疫组化和Western blot法鉴定这些细胞克隆。选取高表达EG-FRvⅢex的细胞株(命名为3T3-vⅢex)免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。用ELISA、Western blot和免疫荧光分别检测抗血清的效价和特异性。结果:成功地构建了真核表达载体pLNCX2-EGFRvⅢex并获得了稳定高表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞系3T3-vⅢex。用3T3-vⅢex免疫小鼠所获得的抗血清效价为10-5。Western blot和免疫荧光鉴定证明抗血清可以与EGFR-vⅢex特异结合。结论:人EGFRvⅢex可在NIH3T3细胞内获得稳定表达,以其免疫小鼠可以获得高效价、高特异性的抗血清。     

人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa CDR3基因片段的克隆及其DNA疫苗制备

目的：为探讨B细胞淋巴瘤细胞膜表面免疫球蛋白可变区的互补决定区3能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体，以人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa为模型，克隆其膜表面免疫球蛋白重链可变区互补决定区3(CDR3)基因片段作为抗原基因，构建DNA疫苗质粒。方法：以RT-PCR的方法获得互补决定区3(CDR3)基因片段，进而克隆了小鼠单核细胞趋化因子(MCP-3)基因作为佐剂分子，以重组PCR的方法获得CDR3和MCP-3基因的融合基因片段，克隆在真核表达载体pcDNA3．1中构建DNA疫苗质粒，然后通过脂质体转染的方法验证该质粒在真核细胞中的表达情况。结果：应用分子生物学的方法获得了以Namalwa细胞mIgCDR3作为抗原基因的DNA疫苗质粒。结论：人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa CDR3基因的DNA疫苗构建正确，体外瞬时转染实验证明该质粒能够在真核细胞中正确表达。所构建的重组表达质粒为下一步的抗B细胞淋巴瘤基因疫苗的体内动物实验工作打下基础。     

人类肿瘤浸润淋巴细胞TCR-β链的优势重排

新近研究表明,在慢性炎症组织中,参与免疫应答的是发生T细胞受体(TCR)重排并表达的优势淋巴细胞群.在恶性肿瘤中,参与免疫应答的也是受选择性抗原刺激发生TCR基因重排或具有相同TCR可变区的优势T淋巴细胞群.该文主要对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的TCR-β链基因重排进行了研究.     

问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

嵌合γδ TCR结构域的αβ TCR分子的同源建模及真核表达

目的设计并构建嵌合γδTCR类免疫球蛋白(Ig)结构域的αβTCR分子,并在Jurkat T细胞中观察其表达。方法通过生物信息学分析确定TCR△Ig分子的融合位点;应用同源建模模拟嵌合TCRα和TCRβ蛋白的三维结构,并应用组合扩展方法(CE)对TCR△Ig分子与野生型TCR分子的蛋白骨架以及抗原识别活性部位进行空间结构比对和分析。采用重叠PCR法分别在TCRα△Ig和TCRβ△Ig的末端融合增强型青色荧光蛋白(ECFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP),并分别克隆入质粒p IRES2-EGFP内部核糖体进入位点(IRES)的上下游。最后将重组表达质粒p IRES-TCRβ△Ig-EYFP/TCRα△Ig-ECFP转染Jurkat T细胞,共聚焦显微镜扫描分析该嵌合TCR分子的表达。结果 TCRα△Ig和TCRβ△Ig的同源建模及三维结构比对结果显示,相比于野生型TCR,该嵌合TCR的可变区(V)结构无改变并且抗原识别活性中心结构保持稳定。重组表达质粒经PCR鉴定及测序分析证明载体构建成功;并且共聚焦显微镜扫描结果显示嵌合TCR分子能定位于T细胞膜表面并正常表达。结论该嵌合TCR分子设计合理,能在Jurkat T细胞表面正常表达。     

CTLA4Ig诱导细胞无能的作用机制探讨

IL 2受体α链 (又称CD2 5 )是T淋巴细胞活化的标志分子 ,CTLA4Ig所诱导的细胞无能CD2 5的表达下降。用FACS方法检测CTLA4Ig诱导的细胞无能的凋亡现象 ,结果发现未处理组与处理组间无差异 ;CTLA4Ig处理后的细胞无能Fas和FasL的表达 ,与未处理对照组无差异。用免疫印迹方法 ,检测发现CTLA4Ig诱导的细胞无能与未处理组相比P2 1Ras没有明显变化。用RT PCR方法检测一些细胞因子mRNA的表达水平 ,发现CTLA4Ig所诱导的细胞无能不能表达IL 2mRNA ,IFN γmR NA的表达下降 ,而IL 4mRNA、IL 10mRNA仍可表达 ,表明细胞无能的基因格局显示Th1基因受抑 ,有向Th2偏移倾向     

多发性骨髓瘤的个体型阳性细胞检查及意义

近年来抗个体型抗体(antiidiotypeantibodies,抗Id抗体)的理论研究及应用有了迅速地发展,已成为免疫学研究中活跃领域之一。个体型是指在同一个体内,不同的抗体形成细胞所产生的免疫球蛋白(Ig)有各自不同的抗原特异性。决定个体型抗原特异性的部位在抗体可变区的超可变区,是针对超可变区某些抗原决定簇的抗体。在     

用于IDDM基因治疗的rAAV2-GAD-Ig的研制

目的: 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD -Ig[GAD- Ig融合基因是由小鼠GAD(glutamicaciddecarboxylase)基因插入到小鼠IgG3重链(Ig)基因的N端而成的 ], 制备含GAD- Ig融合基因cDNA的重组缺陷型腺相关病毒 -2 (rAAV2- GAD -Ig), 并探讨rAAV2所介导的GAD- Ig是否能诱导I型糖尿病(IDDM)动物模型 NOD(nonobesediabetic)小鼠产生特异性免疫耐受。方法: 从含GAD- Ig融合基因的中介载体BSSK(BSSK- GAD- Ig)中, 用PCR方法扩增目的基因片段, 并克隆入真核表达载体pSNAV中, 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD Ig。以脂质体法将pSNAV GAD -Ig转染到rAAV2包装细胞BHK -21中, 产生rAAV2 -GAD- Ig。采用R-T PCR、Westernblot和ELISA法, 检测rAAV2- GAD -Ig感染的BHK- 21细胞中目的基因的表达。应用GAD抗原体外诱导特异性T细胞的二次应答, 来检测rAAV2所介导的GAD -Ig是否能诱导NOD小鼠产生特异性免疫耐受。结果: GAD- Ig目的基因已整合到靶细胞的基因组中, 并能以分泌形式表达目的蛋白GAD- Ig。将rAAV2 GAD- Ig肌注后, NOD小鼠能产生特异性免疫耐受。结论: 获得了可用于NOD小鼠治疗研究的rAAV2 GAD- Ig。     

抑制性T细胞因子抗原结合链的恒定区决定簇

抑制性T细胞因子(TsF)如同免疫球蛋白一样,也具有结合抗原的部分,包括可变区和恒定区。在恒定区,存在表达抗原特异性的同种型决定簇。作者认为,TsF抗原结合链的恒定区决定簇与免疫球蛋白重链恒定区(Igh C)决定簇可能完全不同,前者是由抑制性T细胞第12对染色体的Igh-V基因座位右边的基因所编码产生。     

CTLA4-Ig基因修饰的树突状细胞体外对Th1/Th2平衡的影响

目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4 Ig)基因修饰的树突状细胞(CTLA4 Ig-DCs)体外对Th1/Th2平衡的影响。方法:通过腺病毒载体将目的基因(CTLA4 Ig)转染至小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。采用流式细胞术(FCM)检测DC表面分子和胞内CTLA4 Ig的表达;采用混合淋巴细胞反应检测DC刺激同种异体T细胞的能力,ELISA法检测DC抗原提呈反应中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。结果:CTLA4 Ig基因成功转染至DC,转染率约为80%,制备的CTLA4 Ig-DCs稳定表达CTLA4Ig,表面分子CD86呈现低表达;CTLA4 Ig-DCs可有效抑制T细胞增殖,降低抗原提呈反应上清中IFN-γ和IL-4的分泌,并增加IFN-γ/IL-4比值。结论:通过腺病毒将CTLA4 Ig转染DC并且高效表达,可有效降低DC表面CD86分子,抑制同种异体T细胞反应,并能影响体外Th1/Th2水平。     

噬菌体抗体:丝状噬菌体显示抗体可变区

用聚合酶链反应(PCR)可从杂交瘤和B细胞扩增得到Ig可变区(V)基因,并将其克隆到表达载体中,其后可筛选具结合活性的由细菌分泌的可溶抗体片段。如果在噬菌体表面表达抗体,那么V基因的筛选就方便得多,使用抗原可直接选择携带     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.