人血小板生成素cDNA转染及表达产物对实验性血小板减少症的…

目的 探讨将人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞中及表达产物对实验性小鼠血小板减少症（卡铂诱导）的治疗作用。方法 以哺乳动物表达载体ＰＣＩｎｅｏ为运载体，构建受控于ＳＶ４０早期启动子ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ的表达载体，利用脂质体介导转染技术，将重组ＰＣＩｎｅｏ－ｈＴＰＯ表达载体转染ＣＯＳ－７细胞中，经Ｇ４１８作用后，对挑选阳性克隆ＣＯＳ－７细胞中ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和ｍＲＮＡ分别进行ＰＣＲ     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的 克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）基因,并使其在原核细胞中获得表达。方法 先从人胚胎肝脏中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ获得编码氨基端１９５个氨基酸残基的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ。将该片段亚克隆至ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ克隆质粒中,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ插入到原表达质粒ｐＥＴ２８－ａ中,转化大肠杆菌ＢＬＲ２１（ＤＥ３）,进行诱导表达,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法及免疫印迹法进行检测。结果 得到的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ与文献报道的序列完全一致。经诱导后ｈＴＰＯ基因在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占总菌体蛋白的１０％,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论 得到ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ,并在原核细胞中获得表达,得到截短形式的ｒｈＴＰＯ１９５。     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

重组人促红细胞生成素在COS-7细胞内表达的研究

目的：研究不同真核载体对人促红细胞生成素ｃＤＮＡ的表达效率。方法：人促红细胞生成素ｃＤＮＡ分别用真核表达载体ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＩ、ｐＡｄＣＩ进行重组，脂质体法转化ＣＯＳ ７细胞，以ＴＦ １细胞检测ＥＰＯ的表达活性。结果：感染ｐｃＤＮＡ３ ＥＰＯ，ｐｃＤＩ ＥＰＯ，和ｐＡｄＣＩ ＥＰＯ的ＣＯＳ ７细胞培养上清中人促红细胞生成素活性分别为０５×１０２，１５×１０３和２２×１０２。结论：已构建成可表达具生物活性的重组人促红细胞生成素的真核表达克隆，嵌合内含子序列可增强人促红细胞生成素ＣＤＮＡ的表达效率     

血红素加氧酶—1 cDNA在COS—1细胞内的表达

通过构建表达质粒ｐｃＤＮＡ３ＨＯ１，并在ＣＯＳ－１细胞中的瞬时表达，证实分离的ｃＤＮＡ编码血红素加氧酶－１，以探讨ＨＯ－１在新生期黄疸中的作用机制。实验中构建含编码ＨＯ－１ ｃＤＮＡ的表达型质粒ｐｃＤＮＡ３ＨＯ１，培养ＣＯＳ－１细胞，表达型质粒ｐｃＤＮＡ３ＨＯ１转染ＣＯＳ－１，收集细胞，超声破膜，超速离心得到微粒体颗粒，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）鉴定和酶活性检测，结果显示：ＨＯ     

人甲状腺过氧化物酶的提取,纯化及鉴定

目的：提取较纯的ｈＴＰＯ，为甲状腺激素合成过程的研究和建立ｈＴＰＯＡｂ检测方法提供了实验材料。方法：本文采用胰蛋白酶和脱氧胆酸钠处理手术切除人甲状腺组织，经超速离心和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００柱层析提纯人甲状腺过氧化物酶（ｈＴＰＯ），并进行了愈创木酚氧化法ｈＴＰＯ酶活性测定。结果：本研究获得的ｈＴＰＯ比生物活性为８．４３愈创木酚单位（ＧＵ）／ｍｇ。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定示提纯的ｈＴＰＯ在分子量１０７ｋＤ处有一清晰色带，而于９３ｋＤ处也有一色带，但较浅。结论：该方法提纯ｈＴＰＯ操作简便、快速，获得的ｈＴＰＯ较纯。