大鼠发育过程中视网膜神经节细胞的膜学特性

目的 研究出生后不同发育阶段Wistar大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的膜学特性，包括被动膜学特性和去极化脉冲诱发的动作电位(AIction potential，AP)，并分析其与年龄的关系。方法 应用视网膜切片膜片钳全细胞记录技术，获得7～30dWistar大鼠视网膜神经节细胞的膜片钳全细胞记录。结果 ①记录了112个视网膜神经节细胞；②随着发育，RGCs的膜学特性发生显著变化，兴奋性增加，睁眼前组与睁眼后组间有显著性差异；③去极化脉冲诱发其产生的动作电位有3种形式：单峰型、瞬变型、持续型。随着视觉发育，单峰型逐渐减少，持续型逐渐增加，细胞成熟时未见到单峰型，只见到瞬变型和持续型。随着发育，RGCs的电生理特性发生显著变化。结论 ①睁眼后形觉刺激促进RGCs膜学特性的成熟；②随着发育，RGCs的AP类型发生显著变化，单峰型是RGCs发育过程中的一种前期状态，最终分化为瞬变型和持续型RGCs。     

Long Evans和Wistar大鼠视网膜神经节细胞电生理学及形态学特性比较研究

目的比较Long Evans大鼠和Wistar大鼠睁眼前后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)电生理学特性及形态学特征上的差异.方法取出生后0～31 d Long Evans和Wistar大鼠,各按睁眼时间分为两组,制备视网膜片,行膜片钳全细胞记录,同时行组织切片和细胞内染色,观察形态特征.结果比较22只Long Evans大鼠和24只Wistar大鼠被动膜学特性和动作电位(action potential, AP)幅度及阈值无显著差异,形态学上除两者视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)含或不含色素颗粒外未见明显区别.结论 Long Evans大鼠因其RPE含色素颗粒,以及在视觉和神经系统等方面的优点,可取代Wistar等白化鼠而作为一种良好的视觉和神经科学研究的实验动物模型.     

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞培养与鉴定

目的建立Long Evans大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外培养的方法,为RGCs的体外实验研究奠定基础.方法出生后1～3 d的Long Evans大鼠视网膜神经上皮层,胰蛋白酶 透明质酸酶消化制成单细胞悬液,用DMEM培养液进行培养,观察细胞生长规律,图像分析系统分析有突起的RGCs数目、胞体面积和最长的突起长度,Thy1.1单克隆抗体和微管相差蛋白2多克隆抗体荧光双标法鉴定RGCs.结果 Long Evans大鼠RGCs体外培养存活4 d;荧光双标显示RGCs纯度为80%～90%.结论在普通培养基中Long Evans大鼠RGCs体外培养能获成功.胰蛋白酶 透明质酸酶联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好.     

RCS大鼠病变发育过程中视网膜神经节细胞形态学变化的研究

目的研究皇家外科学院大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)病变发育过程中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)形态学变化.方法取RCS大鼠、RCS-rdy 大鼠3、5、7、9、11周龄视网膜,固定后行视网膜平铺片,甲酚紫染色,使用LEICA DM TRET显微镜及自带的LEICA Q WIN系统软件,观察视网膜神经节细胞层细胞数量总数及RGCs亚群数量上的变化.结果RCS大鼠病变发育过程中,其节细胞层中细胞横径≥12μm的细胞在数量上,7、9、11周龄段相较与3周龄段出现显著减少(P＜0.01).相同周龄段上的视网膜节细胞层中,RCS大鼠与RCS-rdy 大鼠在横径≥12μm的细胞数量上相互比较,可见RCS大鼠从5周龄段开始相较于RCS-rdy 大鼠出现显著减少(P＜0.05),7、9、11周龄段相较与RCS-rdy 大鼠减少更为显著(P＜0.01).但是节细胞层细胞总数及横径≥9 μm的细胞数量上,RCS大鼠自身发育前后对照以及与RCS-rdy 大鼠相比较没有显著差异.结论RCS大鼠视网膜色素变性过程中,随着光感受器细胞的变性和缺失,虽然视网膜节细胞层细胞在整体数量上没有明显变化,但是RCS大鼠视网膜病变发育早期,其节细胞层中胞体横径≥12μm的RGCs在数量上开始出现明显缺失.     

大鼠发育过程中视皮层神经元电学特性的研究

目的 研究大鼠发育过程中视皮层神经元的电生理学特性，探讨相邻神经元之间的相互作用和局部神经元网络的整合功能。方法 应用脑片膜片钳全细胞记录技术(盲法)获得4～28d龄SD大鼠视皮层神经元的全细胞记录，在电压钳下应用强度为0．1—1．0mA刺激来引起神经元的突触后电流(Post synaptic currents，PSCs)。结果 156个大鼠视皮层神经元的PSCs可分为无反应型、单突触反应型和多突触反应型3种类型。大鼠睁眼后多突触反应型细胞所占的百分率显著增加。某些细胞在不同的刺激强度下有不同的突触反应；个别细胞在相同刺激强度下，多突触反应的曲线不同。双脉冲刺激视皮层神经元引起的时间整合作用的形式表现为突触反应增强型、压抑型和无影响型3种类型。结论 多突触反应的神经元可接受两个或多个延时不同的突触输入。视皮层神经元在出生后发育过程中，其功能的成熟表现为在视觉刺激下，视觉依赖性突触的重新分布，表明了相邻神经元之间的相互作用和局部神经元网络的整合功能。     

发育过程中视神经节细胞的膜特性和突触稳定性

目的视神经节细胞(RGC)的膜特性和突触稳定性在发育过程中的变化。方法运用全细胞膜片钳技术,分别记录出生后 7、15和40d3个年龄段的SD大鼠视神经节细胞的动作电位及微小兴奋性突触后电流（mEPSC）,通过Patchmaster软件数据采集 分析神经节细胞的膜特性和突触稳定性。膜特性从主动和被动两方面来分析,突触稳定性从mEPSC的幅度、频率、上升时间和 下降时间等方面来分析。结果通过比较不同年龄段新生SD大鼠RGC的电生理反应特性,发现在发育过程中存在显著改变： 主动膜特性中P15组SD大鼠动作电位发放频率相较于P7组明显变大,动作电位半峰宽变小（P<0.01）,但比较P15组和P40组 的大鼠动作电位发放频率、半峰宽（P=0.086）并无统计学差异;被动膜特性中膜时间常数在发育过程中随着年龄的增加逐渐降 低（P<0.01）。突触稳定性中SD大鼠mEPSCs的频率随着年龄的增加逐渐增大（P<0.01）,但比较P15组和P40组时频率并无明 显统计学差异（P=0.302）。结论发育过程中,RGC的膜特性和突触稳定性发生了规律性改变,并出现了一个关键期,关键期前 RGC的电生理特性变化显著,之后逐渐趋于稳定,这种发育电生理变化是RGC对视觉信号处理的基础特性,有助于了解RGC 在视觉信息中发挥的内在机制。     

RCS大鼠视网膜变性过程中α亚型神经节细胞树突形态学变化

目的研究皇家外科学院大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)视网膜变性过程中α亚型视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)树突形态学变化规律。方法按照视网膜色素变性发展的不同阶段,选取出生后21、30、60、90d的RCS-P+大鼠(RCS组)与RCS-rdy+大鼠(对照组)各3只,采用DiI示踪标记方法观察RCS组α亚型视网膜神经节细胞的树突在视网膜变性过程中形态学变化的规律。结果RCS组各天龄间、对照组大鼠发育过程中各天龄间、RCS组与对照组相对应天龄段间一、二级分支数目之间比较无显著差异(P0.05)。RCS组大鼠视网膜变性过程中,α亚型RGCs树突一级分支直径60d组较21d组变细[(2.02±0.17)μmvs(2.66±0.11)μm,P0.01],RCS组与对照组大鼠α亚型RGCs树突一级分支直径比较,21d增粗[(2.66±0.11)μmvs(2.23±0.10)μm,P0.01]。RCS组90d(15.44±1.50)较21d(26.91±3.01)、30d(27.20±1.99)α亚型RGCs细胞树突分支频率显著减少(P0.01,P0.05)。对照组大鼠发育过程中α亚型RGCs树突分支频率比较,60d(28.67±2.78)较21d(16.09±1.71)、30d(17.75±1.79),90d(26.18±2.48)较21d组有显著增加(P0.01,P0.05),其余各组间没有明显差异(P0.05)。RCS组与对照组大鼠α亚型RGCs树突分支频率相对应21、30、60、90d组间比较均有显著差异(P0.05)。结论RCS大鼠视网膜色素变性过程中,视网膜α亚型RGCs树突分支频率在早期增多,但随着病变的发展到中、晚期树突终末分支显著减少,提示在视网膜变性过程中α亚型RGCs树突的信息传递功能可能发生了变化。     

正常大鼠视网膜感光细胞超微结构在视觉发育关键期中的变化

目的观察出生后大鼠视网膜感光细胞超微结构在视觉发育关键期(7～30 d)中的变化特点.方法10只正常健康Wistar大鼠,8只为新生大鼠,2只为成年大鼠.新生大鼠随机分为4组,每组2只,正常饲养,分别于出生后0、15、20、25 d摘取眼球进行视网膜电镜观察.2只成年大鼠亦进行视网膜电镜观察.结果出生后0 d大鼠,视网膜感光细胞超微结构幼稚且细胞层次不清,关键期内感光细胞的细胞器逐步丰富发育成熟,层次渐显清晰.结论大鼠视网膜感光细胞在视觉发育关键期内逐渐发育、成熟.     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的电生理特性

目的：利用乳鼠视网膜细胞条件分化液将骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为视网膜神经节样细胞,比较BMSCs、诱导后的视网膜神经节样细胞以及原代培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的电生理特性。方法：取传至第3代的大鼠BMSCs,利用乳鼠视网膜细胞条件分化液作为诱导剂,进行增殖培养、分化诱导;免疫组织化学法观察NF、MA...     

正常Long Evans大鼠不同发育阶段闪光视觉诱发电位波形的比较

目的 比较3组不同发育阶段正常Long Evans大鼠的闪光视觉诱发电位(Flash visual evoked potential，F-VEP)的异同，探索闪光视觉诱发电位波形在视觉发育过程中的变化规律。方法 随机抽取不同发育阶段的Long Evarts大鼠50只，分成3组。每组大鼠用乙醚麻醉，使用视觉电生理检查系统采集其F-VEP。结果 未睁眼组未记录到大鼠明显的VEP波形，睁眼后可记录到大鼠F—VEP波形，但成年组和幼年组F-VEP主波(Pmax)的潜伏期和振幅有显著性差异，成年组与幼年组Long Evans大鼠相比，F-VEP主波(Pmax)的潜伏期缩短、振幅减小。结论 随着发育，LongEvans大鼠F-VEP主波(Pmax)的潜伏期缩短、振幅减小。F—VEP对大鼠视觉发育阶段的判断具有一定价值。     

重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的 已证实重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)对中枢神经细胞有抗凋亡作用.本实验探讨rhEPO对压力诱导的视网膜缺血再灌注的影响.方法 大鼠经前房灌注维持眼压102 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),60 min,建立大鼠视网膜缺血再灌注模型.随后立即向右眼玻璃体腔注射5μl rhEPO,左眼玻璃体腔注射同等量的生理盐水,利用荧光金(fluorogold,FG)逆行示踪技术,分别于再灌注损伤后1、4、7、14 d行视网膜节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)计数.结果 rhEPO玻璃体腔注射后各时相点视网膜节细胞数明显高于对照组(P＜0.05).结论 玻璃体腔内注射rhEPO有助于防止视网膜缺血再灌注后视网膜神经节细胞的凋亡.     

视神经损伤后RhoA在大鼠视网膜中的分布及表达研究

目的 观察视神经损伤后RhoA在大鼠视网膜中的分布及表达变化.方法 将36只成年Long Evans大鼠随机分为正常组,视神经损伤1、3、7 d组,共4组,每组9只,通过免疫组化染色,观察RhoA在视网膜中的分布变化;用Western blot分析统计RhoA表达变化.结果 正常及视神经损伤后1 d,RhoA主要分布于视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)层;3 d分布于RGCs及内丛状层;7 d分布于RGCs、内丛状层、内核层及外丛状层.Western blot示:视神经损伤后1、3、7 d,RhoA表达均高于正常组(P＜0.01,P＜0.05),但7 d表达量最高.结论 视神经损伤可显著增加RhoA在视网膜中的表达量及分布范围,它在视神经损伤后再生过程中发挥重要的作用.     

Culture of rat retinal ganglion cells

This study aimed to modify the mixed and purified culture of rat retinal ganglion cells(RGCs) in vitro.The retinae of 1-3 day old Sprague-Dawley(SD) rats were separated bluntly into two layers:inner layer and outer layer,under a surgical microscope.Retinal cells isolated from different layers(inner layer,outer layer and whole retinal tissue) by using enzyme dissociation method were cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.After 3-day culture,the RGCs in the retinal cells obtained from mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue were identified by immunocytochemical staining of Thy-1.1,and the rate of RGCs to retinal cells(RGCs%) was calculated.Two monoclonal antibodies,anti-macrophages/granulocytes(OX-41) against rat macrophage and antibody against rat Thy-1.1(OX-7),were used to purify RGCs by either a conventional or modified two-stepped immunopanning procedure(purification in situ).Purified RGCs were seeded at different cell density and cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.Immunocytochemical staining for Thy-1.1,MTT,and PI-Hoechst33342 fluorescence imaging were used to identify the purity and the viability of RGCs in purified culture of RGCs.The results showed:(1) Immunocytochemistry of different retinal tissue layers culture revealed that the RGCs% was(19.9±1.2)%,(0.5±0.2)%,and(6.2±1.7)% respectively in the mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue,with differences being significant(P<0.05);(2) fluorescent double staining of Hoechst33342 and PI indicated that with the same RGCs%,RGCs obtained from purification in situ grew well with more neurite outgrowth than those by the conventional two-stepped immunopanning method;(3) the viability of purified RGCs seeded at high density was in-creased and the cells developed complex intercellular networks.The viability of RGCs was declined with the decreasing seeding density,and most cells presented round or oval in shape with thin neurites.It was concluded that:(1) RGCs% in the inner layer retina was higher than that in the outer layer retina;(2) RGCs obtained by in situ purification had more neurite outgrowth and lower mortality than those by conventional two-stepped immunopanning procedure;(3) the viability of purified RGCs could be increased by increasing cell seeding density to some extent.     

红参对糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子表达及神经节细胞凋亡的影响

目的:通过观察糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在视网膜表达的变化.探讨红参对RGCs凋亡及VEGF表达的影响以及后两者之间的关系.方法:链脲佐菌素诱导实验性DM大鼠模型.造模成功的DM大鼠随机分为模型组(n=10)和治疗组(n=10),并与末造模的正常组大鼠进行比较.治疗组以红参粉末灌胃给药,1次/d.TUNEL法检测RGCs凋亡并计数RGCs凋亡数量.LSAB法检测VEGF在视网膜的表达.图像分析仪检测免疫组化的显色强度,定量分析.结果:与正常组相比,DM大鼠RGCs凋亡数量显著增加(P<0.01);与模型组相比,治疗组RGCs凋亡数量显著减少(P<0.05).与正常组相比,DM大鼠视网膜VEGF的表达增强:与模型组相比,LSAB法标记染色的VEGF在治疗组表达减弱.结论:红参能抑制DM大鼠视网膜VEGF的表达,减少DM大鼠RGCs的凋亡,DM大鼠RGCs凋亡数量与VEGF在视网膜表达呈正相关.