食蟹猴精原干细胞分离纯化及鉴定

目的掌握食蟹猴精原干细胞 (spermatogonial stem cells,SSCs) 体外培养生长特性,建立食蟹猴精原干细胞分离、纯化、培养及初步鉴定的方法。 方法经手术获取2岁14天食蟹雄猴单侧睾丸,采用三步酶消化法分离获得单细胞悬液和差异贴壁法富集精原干细胞。将细胞培养于经丝裂酶素C处理的STO细胞层上,使用添加神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、GDNF家族受体α (GFRa1) 三种重要生长因子的无血清培养液体外培养,20d后采用CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR对培养的食蟹猴细胞进行SSCs初步鉴定。 结果通过差异贴壁法分离纯化富集的SSCs,接种到丝裂霉素C处理的STO饲养层细胞上,第2天开始分裂增殖。用含有生长因子的培养基培养2 d细胞形成小集落,5 d后细胞集落明显。培养20 d后,SSCs呈葡萄串状细胞簇,符合SSCs的形态特征,这些细胞经CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR均呈阳性表达。 结论本研究成功建立食蟹猴精原干细胞的分离纯化及鉴定体系。基于STO饲养细胞的添加GDNF、bFGF和GFRa1三种生长因子的无血清培养体系可用于食蟹猴精原干细胞培养,CDH1可作为食蟹猴精原干细胞鉴定的标志物。     

乳鼠肌源干细胞的培养及其成肌分化的实验研究

目的体外培养乳鼠肌源干细胞,探讨其成肌分化的能力。方法采用混合酶消化法制备乳鼠肌源干细胞,反复差速贴壁法纯化,利用银环蛇毒素鉴定肌管表面的乙酰胆碱受体,并对相应的与肌分化相关的蛋白进行免疫荧光分析。结果体外培养的肌源干细胞分化成肌管,表达乙酰胆碱受体,且表达骨骼肌和心肌特异性蛋白。结论采用混合酶消化法消化,反复差速贴壁法纯化可以得到多数量高纯度的肌源干细胞。     

恒河猴精原干细胞的筛选、培养与鉴定

目的:建立恒河猴精原干细胞的筛选和培养方法。方法:采用改良的二步酶消化法分离恒河猴睾丸细胞,用改进的差异贴壁筛选法纯化恒河猴精原干细胞,用添加了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、可溶性GFRα1和bFGF的DMEM/F12无血清培养基和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养恒河猴精原干细胞,并通过形态观察、标志基因的免疫细胞化学分析和半定量RT-PCR分析鉴定培养细胞的干细胞活性。结果:分离纯化的恒河猴精原干细胞在添加了3种生长因子的培养基中能形成较大的干细胞克隆,并表达精原干细胞的标志基因。结论:本研究初步建立了恒河猴精原干细胞的培养体系,为进一步开展相关研究奠定基础。     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础。方法取出生24h内的sD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1mm×1mm×1mm大小的组织片;采用胰酶和I型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用“差速贴壁法”进行纯化。通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定。结果镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色呈阳性。结论采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用“差速贴壁法”可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞。     

关于改良差速贴壁法原代培养大型成年哺乳动物绵羊肌源性干细胞的研究

目的探讨改良差速贴壁法原代培养成年大型哺乳类动物绵羊肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSC)的可行性。方法改良差速贴壁法分离培养原代绵羊MDSC,并通过免疫荧光检测及western blotting法检测干细胞抗原-1(stem cell antigen,Sca-1),Desmin及CD 34表达情况。Western blotting法检测贴壁细胞(pp)1~pp6的Desmin表达情况来反应纯化情况。结果利用改良差速贴壁法可以成功分离培养出绵羊MDSC,该干细胞Sca-1,Desmin及CD 34表达均阳性,贴壁慢的细胞Desmin表达增高,在pp6中表达最高。结论改良差速贴壁法可以成功分离培养原代绵羊MDSC,且可扩增至20代。     

新生大鼠心肌细胞原代培养

目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素,对Simpson经典方法进行改进,提高原代心肌细胞存活率及搏动率。方法采用低浓度的胰酶消化3～4次后,再用低浓度的Ⅱ型胶原酶消化一次,用短时间的2次差速贴壁法分离培养心肌细胞。结果在分离培养新生鼠心肌细胞过程中,胰酶和胶原酶合用,并改变差速贴壁时间,得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久。结论分离培养大鼠心肌细胞时,低浓度的胰酶和胶原酶合用,并用2次差速贴壁,可提高原代心肌培养的存活率和纯度,使细胞搏动良好。     

成人成肌细胞的分离与体外培养

目的 建立一种优化的体外成人成肌细胞分离与原代培养方法.方法 首先用两步消化法对取自成人骨骼肌组织进行消化获取相对较纯的成肌细胞,通过差速贴壁法进行进一步的纯化,并对获取的成肌细胞进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析.结果 该方法可获取高纯度的成肌细胞,且在体外可快速稳定增殖.结论 该方法所获取的成肌细胞可为Duchenne肌营养不良的治疗、血友病、血栓闭塞性脉管炎(伯格氏病)、心肌梗死和慢性心衰的基因治疗的研究提供一种充足、可靠的实验靶细胞.     

体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究

目的通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。方法采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。结果复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)%,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P>0.05)。结论初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。     

大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立

目的 建立大鼠体外多器官细胞共培养方法.方法 采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞和真皮成纤维细胞,用锥虫蓝染色法检测细胞分离成活率,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将5种细胞的飞片放入同一培养皿,用体积分数为10%的FBS DMEM培养基培养7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法比较原代细胞在单独培养和共培养时的生长情况.结果 建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,细胞分离成活率均达90%,其中胶原酶消化法培养肝细胞的存活率达90.3%,两步消化法培养肾细胞的细胞存活率达91.9%,心肌细胞的胶原酶消化法细胞存活率达93.0%.3～15 d的心肌细胞搏动频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),差速贴壁法培养的肺泡巨噬细胞存活率可达90.8%,以胶原酶消化法培养的原代真皮细胞存活率达92.7%,细胞生长状态良好.5种原代细胞的多器官细胞共培养结果显示,共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合.结论 所建立的大鼠多器官细胞共培养方法是成功的.     

大鼠表皮干细胞体外分离培养结果观察

目的研究表皮干细胞体外分离培养,为组织工程皮肤的体外构建提供实验依据。方法利用冷热交替消化法对W istar大鼠幼鼠表皮细胞进行培养,然后观察细胞在体外的生长和分化,并且分离表皮干细胞,通过β1整合素、K15以及p63细胞免疫荧光组化染色及扫描电镜对其进行观察及鉴定。结果细胞培养过程中,先后出现梭状细胞、角状细胞和呈集落生长的小圆细胞,集落中心出现竹节状的毛发;β1整合素、K15以及p63均呈阳性表达,表皮干细胞克隆形成率为(15.3±2.3)%,对照组细胞为(6.6±1.1)%,差异有统计学意义(P<0.01);超微结构观察符合表皮干细胞生物学特性,细胞培养体系稳定,利于表皮干细胞生长和分化;在培养体系中出现皮肤附属器。结论体外分离培养的表皮干细胞生物学特点明显,容易发生分化,并产生皮肤附属器。     

大鼠生精细胞分离方法的研究

目的:建立一种简单、有效的哺乳动物睾丸生精细胞分离方法。方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法制备成熟期前大鼠睾丸生精细胞,分析比较其细胞总数、分离所需时间和细胞纯度,以及检测细胞培养前后的存活率。结果:组合酶法得到的睾丸生精细胞总数最多、分离所需时间最短;获得的细胞含杂质最少、细胞存活率最高;细胞培养48h后的存活率高,与其他两种分离方法比较有显著性差异(P<0.05)。结论:用组合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的生精细胞。     

冷冻胚胎经序贯共培养用于建立人胚胎干细胞系

目的:利用长期冷冻人卵裂期胚胎经序贯共培养形成的囊胚建立人类胚胎干细胞系。方法:将冷冻≥10年的卵裂期胚胎复苏后,采用单层卵丘细胞序贯共培养至囊胚期,经辅助孵出,置鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层全胚培养,原代培养6d后加入20%MEF条件培养基培养至形成原代克隆。观察人胚胎干细胞集落的生长状态并通过碱性磷酸酶染色、Oct-4基因表达、核型分析及体外分化实验等方法进行生物学鉴定。结果:9枚冷冻卵裂期胚胎经序贯共培养,有6枚发育到囊胚期,最终获得1株胚胎干细胞系。经鉴定该细胞系具有碱性磷酸酶活性、表达Oct-4胚胎干细胞特异标记、形成拟胚体、在体外形成具有自动节律性的心肌细胞、并具有46,XY核型等5种特性。结论:冷冻胚胎经序贯共培养能够改善胚胎发育潜能,有助于建立人胚胎干细胞系。     

小鼠睾丸支持细胞的原代培养和鉴定

目的 建立小鼠睾丸支持细胞培养方法，为从细胞和分子水平研究环境化合物对雄性生殖系统的影响提供条件。方法 采用两步胶原酶消化，提取出生10d的ICR雄性小鼠睾丸支持细胞，用Tris-HCl处理后除去生精细胞，进一步纯化。倒置相差显微镜和苏木精-伊红（HE）染色观察细胞生长和形态。Feulgen染色法鉴定支持细胞。结果 培养的支持细胞增生活跃，纯度〉95％，Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论 酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行，且细胞纯度较高。为今后研究生殖毒理提供了条件和方法。     

早孕绒毛外细胞滋养细胞的体外培养方法

目的:探讨改良人早孕绒毛外细胞滋养细胞原代分离培养方法。方法:建立改良的复合酶消化梯度离心法,分离培养绒毛外细胞滋养细胞,通过免疫细胞化学、Giemsa染色和细胞侵袭实验检测细胞纯度、数量及生物学活性(侵袭性),并与低浓度胰蛋白酶消化方法进行比较。结果:低浓度胰蛋白酶消化方法和改良的复合酶消化梯度离心法所得贴壁细胞量分别为(11.69±1.26)×104和(17.21±0.51)×104,两者比较有统计学差异(P<0.05);绒毛外细胞滋养细胞纯度分别为(63.20±7.12)%和(92.10±5.11)%,两者比较有统计学差异(P<0.05),穿膜细胞数分别为(36.10±3.28)和(66.20±5.17),两者比较有统计学差异(P<0.05),提示该实验室改良的复合酶消化梯度离心法所得细胞总量、绒毛外细胞滋养细胞纯度及数量均显著高于低浓度胰蛋白酶消化方法。结论:该实验室改良的复合酶消化梯度离心法获得绒毛外细胞滋养细胞纯度和数量显著提高。     

In vitro effects of epidermal growth factor, follicle stimulating hormone and testosterone on mouse spermatogonial cell colony formation

The complex process of spermatogenesis is regulated by various factors. In the present study, the in vitro effects of epidermal growth factor (EGF), follicle stimulating hormone (FSH) and testosterone on spermatogonial cell colony formation were investigated, and the best colonising factor was chosen for treating cells before transplantation. Sertoli and spermatogonial cells were isolated from neonatal mouse testes. The identity of the cells was confirmed through analysis of morphology, alkaline phosphatase activity, immunoreactivity and transplantation. Co-cultured Sertoli and spermatogonial cells were treated with EGF, FSH and testosterone before colony assay. Results indicated that EGF is the best factor for in vitro colonisation of spermatogonial cells, but transplantation of the EGF-treated group did not show any significant change compared with the control groups. In conclusion, EGF increased in vitro colonisation of spermatogonial cells, but, as a result of differential effects, did not influence transplantation efficiency.     

In vitro effects of melatonin on colonization of neonate mouse spermatogonial stem cells

We have recently reported that antioxidant supplements enhance the efficacy of cryopreserved spermatogonial stem cells. Melatonin is considered a free radical scavenger which has direct and indirect antioxidant effects in in vitro and in vivo microenvironments. Due to the anti-apoptotic properties of melatonin, researchers have proposed that melatonin may improve the efficiency of spermatogonial stem cell (SSC) transplantation. However, the appropriate methodology which facilitates SSC proliferation remains to be determined. Identification of a proper propagation system is essential for the future application of SSCs in the field of infertility. The aim of the present study was to investigate the effects of melatonin on the colonization of SSCs. SSCs were isolated from the testes of three to six day old mice, and their purities were assessed by cytometry using Plzf antibody. Isolated testicular cells were cultured in the absence or presence of melatonin extract for two weeks. Suppression of differentiation and maintenance of spermatogonial stem cells was confirmed by alkaline phosphatase staining and immunocytochemistry using Plzf antibody. The number and diameter of the colonies of SSCs were assessed during the 7^th and 14^th days of culture, and the expression of Id4, Plzf, and C-kit were evaluated using real-time PCR at the end of the culture period. The survival rate of the cultured cells in the presence of melatonin was significantly higher than the control group. The number and diameter of colonies also increased in the cells treated with melatonin. The results of our study suggest that culture of SSCs with 100 μM melatonin supplementation can increase SSCs proliferation significantly.     

p,p'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞转铁蛋白表达的影响

目的研究P,P'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞转铁蛋白表达的影响.方法对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养,运用一步法RT-PCR检测给与P,P'-DDE后24 h支持细胞转铁蛋白mRNA水平.结果睾丸支持细胞转铁蛋白mRNA水平随P,P'-DDE所给剂量的增高而降低,且与对照组差异存在显著性(P＜0.05),呈剂量依赖关系.结论P,P'-DDE 可抑制睾丸支持细胞转铁蛋白的基因转录,从而抑制其合成,导致精子发生障碍和生殖功能紊乱.