兔抗人ERA抗血清的制备

目的 在大肠杆菌中表达人ERA蛋白（h-ERA)和h-ERAC端结构域蛋白。并制备兔抗h-ERA抗血清。方法 以PCR扩增人era基因（h-era)全长cDNA和h-ERAC端的结构域基因,并分别克隆到（His)6融合表达载体RSET-C和非融合表达载体pDH中,诱导表达（His)6-h-ERA融合蛋白和h-ERAC端结构域蛋白,用h-ERAC端结构域蛋白免疫兔,制备兔抗h-ERA抗血清,并以Western-blot对兔抗h-ERA抗血清进行鉴定。结果 大肠杆菌中表达的h-ERAC端结构域蛋白和（His)6-h-ERA融合蛋白,分别占菌体总蛋白的40%和80%。用兔抗血清可检出大肠杆菌中表达的（His)6-h-ERA融合蛋白。结论 h-ERA和h-ERAC端结构域蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并成功地制备了兔抗h-ERA抗血清。     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

草原兔尾鼠GST-LZP3融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 :在原核中表达并纯化草原兔尾鼠卵透明带 3 (zonapellu cida3 ,ZP3 ) ,并以其作为抗原 ,制备抗ZP3的抗血清。方法 :将LZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX 4T 1中。经酶切和序列分析后 ,用重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,并经丙基β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST LZP3融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。结果 :成功地构建GST LZP3融合蛋白表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST LZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST LZP3融合蛋白的高效价抗血清。结论 :获得原核表达的GST LZP3融合蛋白并制备了兔抗LZP3的抗血清 ,为采用免疫不育技术进行草原兔尾鼠生育控制的研究提供了重要的制剂     

一种新的丝氨酸蛋白酶ESP30的表达及其多克隆抗体的制备

目的：在大肠杆菌中表达ESP30蛋白，并制备兔抗ESP30抗体。方法：从嗜水气单胞菌基因组中扩增ESP30基因序列，并克隆入非融合表达载体pDH2中，在温度诱导下，表达目的蛋白，以表达的ESP30作为免疫原免疫家兔制备抗ESP30抗血清，抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定。结果：在大肠杆菌中高效表达相对分子质量(Mr)约为66000的ESP30蛋白。ELISA法检测抗血清的效价可达到1：128000，Western blot分析抗血清可与原核表达的ESP30蛋白特异结合。结论：成功地制备兔抗ESP30的抗血清，为进一步研究ESP30蛋白的结构和功能奠定了基础。     

兔抗人DOC-2抗血清的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌中表达的融合蛋白GST-nDOC-2，制备兔抗DOC-2的多克隆抗体。方法将克隆有人DOC-2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)的原核表达载体pGEX-4T-nDOC-2转化大肠杆菌，IPTG诱导表达融合蛋白GST-nDOC-2，经包涵体洗涤后，用其免疫兔，制备兔抗人DOC-2抗血清。并以ELISA、Western blot和免疫组化的方法对抗血清进行鉴定。结果用ElISA法测定抗血清的效价为1：32000；Western blot结果显示对应于GST-nDOC-2融合蛋白位置上有阳性条带；免疫组化结果显示人正常卵巢上皮细胞胞浆呈阳性染色，人卵巢浆液性囊腺瘤上皮细胞染色呈弱阳性，而人卵巢癌浆液性囊腺癌上皮细胞呈阴性染色。结论成功制备了兔抗人DOC-2抗血清，为研究DOC-2的功能提供了有利的工具。     

免抗人BMP—2成熟肽抗血清的制备

目的 利用在大肠杆菌中的人骨形成蛋白－2（hBMP－2）成熟肽，制备兔抗hBMP－2成熟肽抗血清。方法 将含有hBMP－2成熟肽基因的表达载体，pDH2m，转化大肠杆菌，热诱导表达hBMP－2成熟肽，经纯化、复性后，再用其免疫兔子，制备兔抗hBMP－2成熟肽抗血清。并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定。结果 Western-blot结果显示在对应于hBMP－2成熟肽位置有阳性条带，免疫组化结果显示人软骨细胞浆阳性着色。结论 hBMP－2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达，并成功制备了兔抗hBMP－2成熟肽抗血清。     

兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备

目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定.结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色.结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.     

人细胞核诱导凋亡因子1在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人核凋亡诱导因子1(NAIF1)原核表达质粒,在大肠杆菌中表达及纯化NAIF1融合蛋白,制备兔抗NAIF1多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:PCR法获得人NAIF1序列并将其克隆到原核表达载体pET-32a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,经变性、Ni+柱亲和纯化、复性后得到纯化的重组人NAIF1蛋白,免疫大耳白兔,制备兔抗人NAIF1多抗血清,以ELISA和Westernblot方法检测其效价和特异性。结果:成功获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和高效价的兔抗人NAIF1多抗血清,ELISA检测多抗效价达到1∶500000,Westernblot检测证明多抗特异性良好。结论:获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和兔抗人NAIF1多抗血清,为后续针对NAIF1基因功能的研究提供了重要实验材料。     

人磷脂转移蛋白的原核表达及其抗体的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌表达人磷脂转移蛋白(PLTP),制备兔抗人PLTP的多克隆抗血清。方法采用RT-PCR技术,将人PLTP蛋白编码序列克隆入pET-30b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备PLTP抗血清。用间接ELISA法、Western blot、细胞免疫荧光检测对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果SDS-PAGE分析表明,PLTP基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为3h;将纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶256000;Western blot及细胞免疫荧光检测显示,抗血清可以与PLTP原核及真核表达蛋白特异结合。结论成功地将PLTP进行了原核表达,制备了高效价、高特异性的兔抗人PLTP抗血清,为PLTP的临床检测及其结构与功能的进一步研究提供了有力工具。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

YggG截短蛋白的表达及其抗体的制备

目的 :在大肠杆菌中表达截短的YggG蛋白 ,并制备兔抗YggG截短体抗体。方法 :从含有大肠杆菌yggg基因全长DNA的质粒中 ,用PCR扩增截短的yggg基因序列 ,克隆入非融合表达载体pDH2中 ,构建YggG截短体的高表达工程菌 ,并温敏诱导表达非毒性的YggG蛋白 ,薄层扫描检测目的蛋白含量。免疫家兔制备兔抗YggG突变体抗血清 ,并以Western blot检测抗体效价、鉴定抗体特异性。结果 :大肠杆菌中表达的YggG截短突变体蛋白占菌体总蛋白的 3 1.7%。抗血清效价约 1∶2 0 0 0 ,Westernblot分析显示抗血清具有较高的特异性。结论 :成功地获得了YggG截短体蛋白 ,并制备了兔抗YggG突变体抗血清。用制备的该抗血清可检测到野生型全长YggG蛋白的表达     

人金属硫蛋白MT-2a的原核表达、纯化及其抗血清的制备

目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫新西兰大白兔,制备抗血清。用双向凝胶免疫扩散和ELISA检测抗血清的效价,用Westernblot检测抗血清的特异性。结果:经诱导表达及亲和层析纯化,每L菌液可获得可溶性融合蛋白GST-MT-2a38mg。以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备的抗血清,双向免疫扩散效价>1∶256,ELISA效价>1×10-7。Westernblot检测证明抗血清的特异性良好。结论:人MT-2a在大肠杆菌中得到高效表达,以纯化的GST-MT-2a可溶性融合蛋白免疫家兔得到高效价、高特异性的抗血清,为进一步研究MT-2a蛋白的生物学功能提供了重要的制剂。     

小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备

目的：原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清.方法：参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签（EST）序列进行拼接,预测mlrp cDNA序列.用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体.以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用Western blot鉴定抗体的特异性.结果：预测的mlrp cDNA的长度为1 905 bp.将克隆获得的1 554 bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mLRP融合蛋白.以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清.结论：mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础.     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备

目的 用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价.方法 利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清.结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带.对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合.结论 成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清.     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

Notch信号途径效应分子HES1的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达HES1分子，并制备其特异性多克隆抗体，以研究该分子在肿瘤细胞中的表达情况。方法 诱导表达GST-HES1融合蛋白和GST，经谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化后，用GST偶联预激活的Sepharose4B，以GST-HES1为免疫原制备兔抗血清，得到的抗血清经GST-Sepha-rose4B吸收抗GST成分，以间接ELISA和Western blot鉴定抗本特异性，以Western blot分析胃癌，结肠癌及其相应非癌变组织中HES1的表达水平。结果 成功地表达并纯化了GST-HES1融合蛋白，制备的抗HES1多克隆抗体具有很高的特异性，与GST或大肠杆菌成分无交叉反应，用于进行天然HES1分子的Wistern blot检测时效果良好，初步检测发现，胃癌和结肠癌中HES1的表达水平明显高于相应的正常组织。结论 通过原核表达并纯化HES1，成功地制备了该分子的特异性多克隆抗体，初步应用效果满意。     

Cys C单克隆、多克隆抗体的制备及临床应用

目的：制备鼠抗人Cystatin C（Cys C）的单克隆抗体和兔抗人Cys C的多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法：将PQE30-Cys C转化大肠杆菌BL-21,通过IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA agarose亲和层析纯化Cys C蛋白。通过免疫小鼠和大白兔,制备鼠抗人Cys C的单克隆抗体和兔抗人Cys C的多克隆抗体。结果：通过构建含Cys C的原核细胞表达质粒,表达及纯化了Cys C重组蛋白,建立了产生抗Cys C单克隆抗体的杂交瘤细胞株,及制备了兔抗人Cys C的多克隆抗体,末次抗血清效价为1：1000000,经过ELISA证实用CysC免疫的大白兔所制备的抗血清可与Cys C发生特异性的免疫反应。结论：本文成功制备鼠抗人Cys C的单克隆抗体和兔抗人Cys C的多克隆抗体,建立了ELISA检测Cys C,为用于临床奠定了基础。     

降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

目的:构建降钙素原(PCT)原核表达载体, 制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定.方法:以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 在大肠杆菌中分别表达GST-PCT和His-PCT融合蛋白, 用His-PCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb.通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价;用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性.使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性. 结果:构建了重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 并在大肠杆菌中表达、纯化.经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶ 256 000.制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白.获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白. 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础.     

兔抗MAGE-n血清的制备、纯化及鉴定

目的: 制备高效价、特异性的兔抗人MAGE-n血清。方法: 对原核表达的MAGE-n蛋白进行纯化, 与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔制备抗血清, 用硫酸铵盐析法及溴化氰活化的Sephrose4B(CNBr-ActivatedSephrose4B)亲和层析柱纯化抗血清, 以双向免疫扩散实验、ELISA、Westernblot和免疫组化对兔抗人MAGE-n血清进行鉴定。结果: 经免疫得到高效价的兔抗人MAGE-n血清, 抗血清能够与MAGE-n特异性结合, 免疫组化结果表明MAGE-n是一种胞质蛋白。结论: 用MAGE-n蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔, 制备得到高效价的抗血清, 纯化后的特异性兔抗人MAGE-n血清, 为进一步研究MAGE-n在各种组织中的表达奠定了基础。