巨噬细胞集落刺激因子/核因子κB受体激活物配体体外诱导培养高纯度破骨细胞:最佳剂量探讨

背景:巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stlimulating factor,M-CSF)/核因子κB受体激活物配体(receptor activatorof nuclear kappa B ligand,RANKL)两种细胞因子协同诱导骨髓干细胞形成破骨细胞是一种较新的,可以获取较高纯度和数量破骨细胞的诱导培养法,但尚缺乏统一的培养标准。目的:建立有效的M-CSF/RANKL诱导小鼠骨髓干细胞诱导分化破骨细胞的培养体系。方法:分离小鼠四肢骨获取骨髓干细胞。将小鼠骨髓干细胞在含有M-CSF的α-MEM培养基中培养24h,调整细胞浓度为107,108,109L-1。然后在培养基中同时加入10μg/LM-CSF和不同质量浓度(20,50,100μg/L)RANKL。行抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察干细胞向破骨细胞的转变过程及细胞形态和染色情况,并对各组染色阳性的破骨细胞进行计数,比较不同诱导条件对破骨样细胞数量的影响。结果与结论:培养3d后可见少量破骨样细胞,胞质内含许多红色抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性颗粒,细胞内可见淡染的双核;培养6d后可见大量染色阳性破骨样细胞;培养9d后出现多核巨型染色阳性破骨样细胞,细胞明显增大,细胞核可达到3个以上。在固定细胞接种浓度条件下,RANKL质量浓度为100μg/L时诱导分化形成的破骨样细胞数量较另两质量浓度增多(P0.05);在固定RANKL质量浓度条件下,细胞浓度为108L-1时诱导分化形成的破骨样细胞数量较另两细胞接种浓度增多(P0.05);细胞接种浓度为108L-1,RANKL质量浓度为100μg/L时诱导分化形成的破骨样细胞数量高于其他条件组合(P0.05)。说明在M-CSF/RANKL诱导小鼠骨髓干细胞分化培养破骨细胞的体系中,RANKL最佳质量浓度为100μg/L,最佳细胞接种浓度为108L-1。     

外周血单个核细胞诱导培养破骨细胞

目的：从人外周血单个核细胞诱导培养获得高产量高纯度破骨细胞，为破骨细胞的体外研究提供丰富的细胞来源。 方法：从外周血分离单个核细胞贴壁培养，采用0.25％胰蛋白酶／0.02％EDTA联合消化，纯化后以RANKL和M-CSF加以诱导(A组)，并与未经消化之传统方法（B组）比较。结果：与B组相比，A组可获得(1 426±204)个破骨细胞（P<0.05），0.25％胰蛋白酶／0.02％EDTA联合消化可使破骨细胞纯化率达90％。诱导生成的破骨细胞TRAP染色阳性，功能试验显示具有噬骨能力。结论：联合消化结合RANKL/M-CSF诱导培养法可产生大量的破骨样细胞，方法简便而且经济实用。     

核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞前体的培养与分化

背景：以往的研究多采用长骨机械分离法获得破骨细胞,破骨细胞为终末分化细胞,无法进一步增殖和传代。因此目前常用骨髓细胞诱导培养法和RAW264.7细胞诱导培养法获得大量的破骨细胞以满足实验需要。 目的：探讨细胞核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞的最佳方法。 方法：分离小鼠骨髓细胞后添加核因子κB受体活化因子配体与巨噬细胞集落刺激因子共同诱导或者取RAW264.7细胞单独加入核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞的形成;分别给予不同浓度的核因子κB受体活化因子配体,观察生成破骨细胞的数量,评价核因子κB受体活化因子配体与破骨细胞生成的量效关系;采用膜联蛋白V-FITC联合PI染色进行流式细胞术分析破骨细胞形成过程中单核巨噬细胞的凋亡情况。 结果与结论：当核因子κB受体活化因子配体浓度为10 μg/L时,破骨细胞形成数量最多的时间点在第六至七天;而核因子κB受体活化因子配体浓度为100 μg/L时,高峰期出现在第四至五天。破骨细胞的形成数量随着核因子κB受体活化因子配体刺激浓度升高而增加,呈浓度依赖性,50 μg/L的核因子κB受体活化因子配体是破骨细胞形成数量与浓度关系曲线的转折点,高于150 μg/L以后破骨细胞形成数量的增幅明显放缓。核因子κB受体活化因子配体即能诱导单核巨噬细胞形成破骨细胞又可以促进其凋亡,通过破骨细胞计数比较发现在同一浓度(104/cm²)接种单核巨噬细胞后以30 μg/L的核因子κB受体活化因子配体诱导后,平均每单位核因子κB受体活化因子配体所获得的破骨细胞数量最多。提示骨髓细胞或RAW264.7细胞诱导破骨细胞的培养方法皆简单可行,细胞接种的最佳浓度为104/cm²;核因子κB受体活化因子配体的适宜刺激浓度为30-50 μg/L。     

紫草素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞表型及功能的影响

目的探讨紫草素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞表型及功能的影响。方法从健康人外周血中分离获得单个核细胞,经过夜贴壁后获得单核细胞,体外采用多种细胞因子联合诱导,获得了分化与功能相对成熟的树突状细胞。采用流式细胞仪检测技术观察不同质量浓度紫草素对DC表面分子表达的影响,采用CCK-8法观察紫草素对树突状细胞促淋巴细胞增殖以及ELISA法检测其对树突状细胞分泌细胞因子IL-23的干预作用。结果 TNF-α25 ng/ml刺激树突状细胞,细胞表面分子CD80、CD83表达升高,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力增强;100μg/ml紫草素可抑制CD80及CD86的表达,50μg/ml紫草素可抑制CD86的表达;100μg/ml紫草素和50μg/ml紫草素均可抑制树突状细胞促淋巴细胞增殖的能力;100μg/ml紫草素和50μg/ml紫草素均可抑制LPS和INF-γ联合诱导的树突状细胞IL-23的分泌。结论紫草素具有一定的抑制树突状细胞成熟及抑制其分泌IL-23的作用。     

人外周血单个核细胞向肝样细胞转化的体外诱导培养方法*

背景：外周血单个核细胞在体外条件下可向肝样细胞转化。 目的：探索体外诱导外周血单个核细胞向肝样细胞分化的培养方法。 方法：采用密度梯度离心法联合贴壁法纯化肝硬化患者外周血单个核细胞,以含巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素3及β-巯基乙醇培养基培养6 d后,诱导组用含肝细胞生长因子,成纤维细胞生长因子4的培养基培养14 d;以未诱导培养的单个核细胞及L02肝脏细胞系为对照。 结果与结论：外周血单个核细胞呈透明圆形、类圆形,用巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素3及 β-巯基乙醇培养基培养6 d后,部分细胞向成纤维样细胞生长,诱导后部分细胞呈多边形,多角形,14 d后细胞形态逐渐接近肝细胞,并表达白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18。说明在一定的诱导条件下,外周血单个核细胞在体外可以向肝样细胞分化。 关键词：肝样细胞;外周血;单个核细胞;诱导;分化;干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.018     

双氢青蒿素抑制核因子κB受体激动剂配体诱导RAW264.7细胞分化破骨细胞的研究

目的 探讨双氢青蒿素(DA)对核因子κB受体激动剂配体(RANKL)诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞的影响。方法 通过细胞计数试剂盒(CCK-8)确定不同浓度(1、5、10、50、100、200 μmol/L)DA对RAW264.7细胞的生存影响。分别用50 ng/mL RANKL及50 ng/mL RANKL+5、10、50、100 μmol/L DA诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞,共3 d。对形成的破骨细胞用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并计数,TRAP染色阳性且细胞核数目＞3个认为是成熟的破骨细胞。50 ng/mL RANKL及50 ng/mL RANKL+10、100 μmol/L DA培养RAW264.7细胞24 h,用Trizol试剂提取总RNA,并使用荧光实时定量PCR检测破骨细胞分化相关基因NFATc1、c-fos及Cathepsin K的表达。结果 1、5、10、50、100 μmol/L DA对RAW264.7细胞毒性较小,细胞存活率均＞90%。TRAP染色显示,5、10、50、100 μmol/L DA可以减少RANKL诱导成熟破骨细胞的数目,并呈剂量依赖关系(F=139.156, P＜0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,10、100 μmol/L DA具有下调破骨细胞分化关键基因NFATc1和c-fos表达的作用,且100 μmol/L抑制作用比10 μmol/L明显,但两种浓度DA对Cathepsin K的表达无明显影响。结论 DA对RAW 264.7细胞毒性较低,通过下调RAW 264.7细胞NFATc1和c-fos基因表达抑制RANKL诱导破骨细胞形成。DA可以作为治疗骨质破坏性疾病的潜在药物。     

维生素D3对人外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响

目的观察不同浓度1α,25-(OH)2-D3对外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响及时间效应,旨在探讨1α,25-(OH)2-D3治疗疾病的可能机制。方法应用反转录-聚合酶链反应技术分别检测不同浓度(1×10-5、1×10-6、1×10-7 mol/L)1α,25-(OH)2-D3对外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响,同时检测每个浓度作用不同时间(6、12、24、48 h)对外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达的影响。结果不同浓度1α,25-(OH)2-D3作用不同时间,对人外周血单个核细胞CCR5 mRNA表达均有不同程度抑制作用,呈现一定的浓度和时间依赖性,当浓度为1×10-5 mol/L的1α,25-(OH)2-D3处理人外周血单个核细胞48 h后该作用达高峰(P<0.05)。结论 1α,25-(OH)2-D3可在转录水平抑制CCR5表达,这可能是1α,25-(OH)2-D3治疗疾病的作用机制之一。     

人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆

目的 从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA.方法 用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果 单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3 h,6 h和12 h后.TLR2和TLR4表达并不相同.15 μg/mL脂多糖作用6 h TLR2表达最高,10 μg/mL脂多糖作用3 hTLR4表达最高.经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1 700 bp和1 900 bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的 片段与GenBank中序列一致.结论 脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA.     

糖皮质激素对体外中央记忆性CD8~+ T淋巴细胞的诱导分化作用

目的:以糖皮质激素对人CD8~+ T淋巴细胞的诱导作用为线索,探究其对体外CD8~+ 中央记忆性T淋巴细胞(central memory T cells,T_(CM))的诱导分化作用,以期为CD8~+ T_(CM)过继性免疫疗法提供新的扩增方案。方法:通过密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞,经磁珠和流式细胞术分选出初始CD8~+ T细胞,将细胞使用细胞因子激活之后分为对照组和实验组,在实验组中加入不同浓度的2种糖皮质激素(醋酸可的松和氢化可的松),进行体外培养,最后通过流式细胞术检测2组细胞中CD8~+ T_(CM)的诱导分化情况,并通过CFSE染色判断细胞增殖情况,通过早期凋亡试剂Annexin V染色判断药物本身对CD8~+ T细胞的毒性作用。结果:浓度梯度实验发现,1μmol/L醋酸可的松对CD8~+ T_(CM)表现出良好的诱导效果,氢化可的松在0.5μmol/L的诱导效果较好。分别在体外培养的第3天和第6天,CFSE染色法检测细胞的增殖情况,经统计学分析发现实验组和对照组之间的差异无统计学显著性,表明糖皮质激素不影响细胞的自然增殖。Annexin V染色法表明,这2种药物无显著的促进凋亡作用,对淋巴细胞毒性小。结论:糖皮质激素在体外对人CD8~+ T_(CM)具有良好的诱导作用。这为改善过继免疫治疗中T_(CM)的体外扩增提供新的参考方法,并且在理论上加深对糖皮质激素生物学功能的理解。     

胰岛素样生长因子1对小鼠成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

背景:胰岛素样生长因子1是骨形成的调节因子,具有促进有丝分裂、促进成骨等作用。由骨细胞所产生的胰岛素样生长因子1在调节成骨细胞和破骨细胞介导的骨骼重建中起着重要的作用。目的:观察胰岛素样生长因子1作用后,小鼠成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的表达。方法:在体外培养的小鼠成骨细胞中分别加入25,50,100及200μg/L的胰岛素样生长因子1,于培养的第1,2,3,4,5天用Cell CountingKit-8比色法检测细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞的增殖周期和凋亡率;于培养的第3,6,9天应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性。结果与结论:胰岛素样生长因子1质量浓度在25～200μg/L时,对小鼠成骨细胞的增殖率有明显的促进作用(P0.05),且呈明显的浓度依赖效应。当胰岛素样生长因子1质量浓度在200μg/L时,能明显提高细胞S期所占的比例。说明胰岛素样生长因子1可加速细胞的增殖活动,以保证参与骨改建的成骨细胞数量而促进骨组织再生。同时,胰岛素样生长因子1在25～200μg/L时,能显著提高细胞内碱性磷酸酶活性(P0.05),促进成骨细胞分化。     

局部注射辛伐他汀对骨质疏松大鼠股骨髁骨小梁的改建效应

背景：局部注射具有成骨作用的辛伐他汀,可显著增加骨质疏松大鼠股骨颈及股骨髁部的骨密度及力学强度,分析局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。 目的：进一步研究骨质疏松大鼠股骨内局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。为将辛伐他汀应用于临床骨质疏松局部治疗提供实验基础。 方法：18只雌性SD大鼠双侧卵巢切除后3个月,制备大鼠骨质疏松模型。实验大鼠随机数字表法均分为3组,分别在实验大鼠的右侧股骨髓腔内单次注射辛伐他汀溶液5 mg、10 mg,对照组单纯注射空白载体。分别在注射后1个月处死大鼠并取材。Micro-CT扫描并定量分析骨组织形态变化。 结果与结论：给药后1个月,Micro-CT扫描结果显示,辛伐他汀治疗组的骨微结构参数如骨皮质厚度、骨小梁密度及连接率明显优于对照组。说明疏松骨骼单次注射小剂量辛伐他汀可显著促进股骨髁部骨小梁改建,改善骨骼微结构,可为强化局部、防治骨质疏松骨折的新选择进一步提供实验基础。     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

石斛属民族药用植物的分类及生药学研究

中药石斛早在《神农本草经》中就被列为上品,其应用历史悠久,具有养阴生津、补肾益气、润喉护嗓、活血明目、抗癌防老等功效。本文对国内外石斛属民族药用植物的分类及生药学研究进行了综述。     

Effect of route of antitoxin administration on efficacy of treatment of experimental tetanus

The efficacy of treatment with Diaform-3 antitoxin, given by either intracisternal or intralumbar injection in a dose of 400 i.u./kg, was compared in experiments on 100 rabbits with ascending, hematogenous, and cerebral tetanus caused by injection of 1 c.l.d. of tetanus toxin. Intracisternal injection of the antitoxin was found to be three times more effective than intralumbar (the proportion of animals cured was 31.4 and 10.2% respectively). The latter was effective only in animals with ascending tetanus, evidently because the portal of entry of the toxin into the CNS was along the peripheral nerves of the hind limbs.Central Research Laboratory, L'vov Medical Institute. (Presented by Academician of the Academy of Medical Sciences of the USSR A. M. Chernukh.) Translated from Byulleten' Éksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 86, No. 8, pp. 212–213, August, 1978.     

Effect of ultralow doses of thyroliberin on microviscosity of lipid components of biological membranes

Effects of the regulatory peptide thyroliberin on microviscosity of lipid components of endoplasmic reticulum biological membranes in mouse hepatocytes were studied by electron paramagnetic resonance. Thyroliberin in a concentration of 10⁻³–10⁻¹⁸ M decreased microviscosity of surface layers of membrane lipids. This decrease was the most pronounced (30%) under effects of 10⁻¹⁰ and 10⁻¹⁶ M thyroliberin. Physiological effects of thyroliberin corresponded to its influence on the membrane structure. Translated fromByulleten' Eksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 129, No. 1, pp. 38–40, January, 2000     

膝关节骨性关节炎的关节镜治疗体会

目的我科自2001～2005年4月对59例67膝的骨性关节炎（0A），进行关节镜检查及镜下清理术。方法镜检：膝关节骨性关节炎伴不同程度滑膜炎，滑膜皱壁粘连纤维片，关节软骨不同程度破坏。镜下清除增生滑膜，松解粘连，去除剥脱软骨、修复关节面。结果随访2月～4年，平均1.5年，术后综合评估2月～1年，优良率94％；1～2年，优良率79.2％；2年以上优良率54.8％。结论关节镜对膝关节骨性关节炎诊断能提供了比较全面的资料，并对骨性关节炎早期有良好疗效，具有创伤小、恢复快、并发症少和重复治疗等优点。     

Assessment of the efficacy of treatment of hemangiomas

Assessment of the aftereffects of cryoexposure and ultrahigh-frequency cryoexposure on hemangioma tissue of various types, cavernous and squamous, showed a higher cryogenic effect in hemangiomatous tissue preexposed to ultrahigh-frequency waves. A quantitative criterion is proposed for assessing the efficacy of the studied methods of exposure. Translated fromByulleten' Eksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 119, N ^o 6, pp. 669–672, June, 1995     

Localization of cytoplasmic antigens of cells of differentiated layers of the epidermis in epithelium of the human thymus

N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow. (Presented by Academician of the Academy of Medical Sciences of the USSR S. V. Prozorovskii.) Translated from Byulleten' Éksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 109, No. 3, pp. 308–310, March, 1990.