TAIL-PCR研究进展及其在畜牧兽医中的应用

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)是一种以PCR为基础的染色体步移,主要用于分离已知基因的侧翼序列,具有简便、快速、高效、特异性强等特点.文章从TAIL-PCR的原理、优势及局限性、反应体系优化等方面对TAIL-PCR的研究进展进行综述,其中在畜牧兽医中主要用于已知基因侧翼克隆和转基因动物模型外源基因插入位点确定.但由于基因组DNA的庞大和复杂性,使得从基因组中克隆获得目的基因仍存在诸多限制因素,如特异性引物错配和随机引物结合位点不确定,易造成非特异性产物的产生;模板GC含量异常或存在高度重复序列时,即使使用多种简并引物也难以获得阳性产物.因此,应根据实际情况对TAIL-PCR进行灵活调整.当模板较复杂时,可借鉴连接介导PCR原理,给引物加上接头,提高扩增反应的特异性;当模板较简单或序列较清晰时,可根据模板特点(如高GC含量)或已知模板序列设计引物、调整反应条件,增加操作的简便性;还可参考Suppression-PCR原理,选择引物和反应条件,获得较长的扩增片段.此外,TAIL-PCR可与多种技术联合使用,促使其在畜牧兽医中获得更广泛深入的应用.     

外源基因插入位点旁侧序列的研究方法及进展

外源基因插入位点的研究,是转基因植株分子检测的一项重要内容。本文综述了近些年用于旁侧序列测定的染色体步移技术及其发展,介绍了基于基因组文库和PCR的染色体步移技术。同时总结了基因组文库步移、反向PCR、锅饼PCR、T-linker PCR和TAIL-PCR的原理及其特点,以期在实验方法的选择上提供参考意见。     

种子特异启动子的克隆及植物表达载体构建

[目的]启动子是植物基因工程中一个重要工具,对构建植物生物反应器有着重要意义。8S球蛋白是绿豆中含量最丰富的种子贮藏蛋白,因此,其调控序列可能提供了一个很好来源的种子特异性启动子。[方法]通过基因组步移技术克隆了绿豆8s球蛋白a亚基基因8SGα的启动子区域,基因组步移使用的引物根据绿豆8SGα的cDNA序列设计。[结果]通过3轮PCR的扩增,得到了472bp的上游序列片段,构建了植物双元表达载体pBI－8SGα-GUS。[结论]研究结果可用于转化植物,并于转基因植物中分析启动表达的时空特异性及表达强度,并为植物种子生物反应器提供重要元件。     

转HaNAC基因棉花的分子鉴定及遗传稳定性分析

棉花是世界上重要的经济作物之一。为创制和改良棉花抗旱新品种提供种质资源及遗传育种研究提供理论依据，通过染色体步移技术明确外源基因在棉花染色体上的插入位点、序列及染色体信息，研究了转梭梭HaNAC基因的棉花材料对干旱胁迫的响应能力，确定了HaNAC基因的物理位置，鉴定了其遗传稳定性。研究结果如下：(1)本研究对转HaNAC38转录因子基因棉花材料进行了分子鉴定，通过PCR扩增、电泳检测及测序证实了转基因植株中分别存在标记基因和目的基因序列。应用半定量PCR,证明了HaNAC38基因在棉花受干旱胁迫后表达量上调。这些结果说明转HaNAC38基因T6代棉花植株的遗传稳定性。(2)通过标记基因的初步筛选获得阳性植株后，对转基因棉花进行外源基因的检测鉴定，利用获得的序列设计染色体步移引物，通过巢式PCR方法获得转HaNAC38基因棉花的T-DNA序列在基因组中的插入位置，结果定位到棉花基因组A11染色体第26 202 323 bp处。根据已知的棉花基因组信息，通过鉴定，共筛选转HaNAC38基因的棉花材料5个株系，为创制和改良棉花抗旱新品种提供了亲本材料。     

番茄根特异表达基因LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论克隆获得了番茄LeGRP2基因启动子,该启动子主要在转基因拟南芥根部表达GUS基因,具有较强的根表达特异性。     

鲫鱼基因组DNA的扩增及在SSR分析中的验证

【目的】优化鲫鱼全基因组DNA扩增方法。【方法】使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。【结果】使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头后PCR扩增,获得扩增产物集中于250～1 500 bp。以扩增的滇池高背鲫鱼基因组DNA为模板,PCR扩增滇池高背鲫鱼的微卫星分子标记(SSR)位点,获得预期的扩增片段,电泳图谱与对照组(未扩增的基因组DNA为PCR模板)无差异。【结论】本研究优化了鲫鱼基因组DNA的扩增方法,并可用于SSR分析中,为鱼类大规模遗传分析提供了技术支撑。     

基因组步移技术克隆稀有鮈鲫角蛋白18基因序列及序列分析

角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鮈鲫基因组中PCR扩增得到2 779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鮈鲫角蛋白18基因全长3 765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）预测表明稀有鮈鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。     

基因组步移技术克隆稀有鲫角蛋白18基因序列及序列分析

角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鲫基因组中PCR扩增得到2 779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19-T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鲫角蛋白18基因全长3 765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)预测表明稀有鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。研究亮点:首次成功克隆了稀有鲫角蛋白18基因全长序列3 765 bp,并且通过软件预测分析得出氨基酸序列,把氨基酸序列在DNA序列中进行标记,显示稀有鲫角蛋白18基因全长序列含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸。另外,没有采用常用的从RNA反转...     

芥菜型油菜A9染色体黄籽基因区域BAC重叠群的构建

A9染色体是芸薹属植物A基因组最长的染色体(序列约37 Mb),具有控制种子大小、种皮颜色、硫苷合成、油脂合成等重要性状的基因。利用芥菜型油菜A9染色体黄籽性状共分离标记A9-88和A9-32对已经构建的ZBjH BAC文库进行PCR步移筛选,共筛选出BAC 752个,测序395个,得到BAC末端序列674条,利用BAC末端序列设计引物533对,此外利用白菜已经公布的序列设计SSR引物38对、STS引物15对,构建了芥菜型油菜黄籽基因区域估算长约2.2 Mb的BAC重叠群。     

2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列比较

比较了扩增已知序列5’侧翼序列的2种PCR方法.方法一是反向PCR (IPCR),以大豆基因组酶切后的DNA片段自身环化产物做模板,用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列.方法二是热不对称交错PCR(rAIL- PCR),以大豆基因组DNA为模板,用3个巢武特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环.IPCR和TAIL- PCR 2种试验方法分别扩增获得438 bp和867 bp特异产物.经测序发现:2片段两侧均含有设计的引物,其部分序列均与已知序列相一致,两者也有部分序列完全相同,但TAIL- PCR技术简单,重复性好,能够在短时间内获得目标片段,TAIL-PCR技术在克隆侧翼序列时优于IPCR.     

福建省国有林场伐区道路技术标准探讨

根据福建省的地形地貌和我国生产的轻型运输机械类型，探讨建设我省国有林场既能满足现有的伐区生产，又利于今后改造的林道形式——轻型车道、手扶拖拉机道．从轻型农用车、手扶拖拉机的运输机械性能上研究它们在林道上行驶车速、道路宽度、纵坡、最小转弯半径等适应的范围，以及这２种林道建设技术标准．并按有关道路建设理论探讨国有林场伐区道路的技术标准     

三孢布拉氏霉乳清酸核苷-5''-单磷酸脱羧酶基因的PCR扩增与序列分析

根据对卷枝毛霉Mucor circinelloides、布氏须霉Phycomyces blakesleeanu、雪白根霉Rhizo pus niveu、少根根霉Rhizo pus arrhizus和微小根毛霉Rhizomucor pusillus的乳清酸核苷-5‘-单磷酸脱羧酶基因核酸序列的同源性分析,在第3个外显子内根据卷枝毛霉基因序列设计1对引物,以三孢布拉氏霉Blakeslea trispora基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到1个长度约为500bp的产物。经过同源性分析证明该产物为三孢布拉氏霉乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因片段。在此基础上,采用抑制性PCR扩增技术,进行染色体步行,分别克隆染色体上相邻的DNA片段,测定了基因的全序列,并对该序列进行了分析。结果表明：在外显子区域核酸序列与卷枝毛霉、少根根霉和微小根毛霉的同源率分别为82％,81％和79％。     

皮带松紧度检测仪的研制与测试分析

研究了拖拉机传动皮带松紧度对摩擦功率和滑转功率的影响,得出皮带松紧度的最佳范围为２５～３０ｍｍ．并研制了一种实用的皮带松紧度检测仪,对使用中拖拉机的１２１根皮带的松紧度进行了检测,发现６０％的皮带偏松或过紧,需进行调整．     

改善手扶拖拉机运输机组性能的分析研究

 对改善手扶拖拉机运输机组的性能进行了分析和探讨,并对目前手扶拖拉机运输机组所存在的问题提出了改进性意见,通过分析对比各种方案,认为变牵引型为驱动型的拖斗驱动方式能够很好地提高手扶拖拉机的综合利用率,增加其附着性能以及安全性能。     

高强度高耐磨铸造齿轮的研究与应用

The remarkable combination of strength,ductility and wear resistance can be obtained in austempered ductile irons (ADI). In this paper,the experimental resuits at the application of ADI for gears in walking tractor''s gear box to replace 20CrMnTi carburize     

马尾松银松素合酶基因启动子区的克隆及特征分析

银松素合酶(pinosylvin synthase,PS)是合成银松素类植物抗毒素的关键酶。本文根据前期工作所获得的PS基因序列,设计基因特异引物,利用连接介导的染色体步行技术,从马尾松总基因组中扩增PS基因上游的启动子区;通过PLAN-CARE等分析软件对5′侧翼区近700 bp进行启动子特征分析,预测启动子区调控元件。结果表明,在翻译起始密码子上游167 nt处可能存在TATA-box。此外还发现3个GATA-box(-260 nt、-295 nt、-386 nt和-295 nt)和若干个TGAC-like序列。     

手扶拖拉机运输中的合理车速与载重量

通过对手扶拖拉机传动系统和动力性能等方面的分析,提出了东风-12型手扶拖拉机在运输作业中的车速以不超过最大理论运输速度较为适宜.作者由车速,进而又分析了手扶拖拉机的牵引力和停车制动等问题.认为东风-12型手扶拖拉机在运输中的载重量以不大于1.5吨为宜.     

用于染色体步行的PCR技术

对用于染色体步行的PCR技术进行了综述，将已报道的11种用于兆色体步行的PCR技术分为4类，指出了各种技术方法的优点及成功运用的例子，并对这些技术的局限性和今后发展的趋势进行了探讨。