紫苏FAD3基因的克隆与表达分析

ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)是植物脂肪酸合成途径的关键限速酶,通过调节该酶的过量表达,可以使植物中的α-亚麻酸(ALA)含量增加。本研究采用RT-PCR的方法,以紫苏L1品系为材料,克隆得到一个ω-3脂肪酸脱氢酶基因PfFAD3。生物信息学分析结果显示PfFAD3开放阅读框为1 176 bp,编码319个氨基酸,推测其蛋白分子量为44.7 k D,等电点为9.19;PfFAD3较为保守,具有四个富含组氨酸的保守区域。q RT-PCR结果表明,PfFAD3基因具有组织表达特异性,在种子中的表达量远高于其它器官。同时,研究了外源Me JA和温度对紫苏茎和叶中PfFAD3基因表达的影响,结果显示外源Me JA能够快速诱导叶片中PfFAD3基因表达量的上调,而抑制PfFAD3基因在茎中的表达;低温能够诱导叶片中PfFAD3基因表达量上调,而高温则抑制叶与茎中PfFAD3基因的表达,表明PfFAD3基因可能参与紫苏的防御反应。     

水稻YABBY家族的全基因组鉴定与表达分析

YABBY转录因子家族广泛参与植物的生长发育,但在单子叶植物的作用机理有待进一步研究。本研究利用生物信息学方法系统分析了水稻YABBY家族成员。保守性分析表明,水稻基因组中共有8个YABBY成员,不均匀地分布在2、3、7、10和12染色体上,成员之间相对保守,分为四个亚族。进化分析表明,片段复制或全基因组复制是YABBY基因在进化过程中的主要扩张方式,且YABBY家族的分化可能晚于单双子叶植物的分化。启动子和表达分析表明,水稻YABBY家族成员可能在水稻的花器官的发育、多中激素的响应中具有重要的作用。本研究为水稻YABBY基因的功能鉴定提供了理论支持和参考依据。     

水稻转高赖氨酸蛋白质基因(sb401)植株的获得及种子中蛋白质和氨基酸的含量分析

用来源于马铃薯花粉的高赖氨酸蛋白质基因和玉米醇溶蛋白基因启动子构建了一个植物表达载体。采用农杆菌法导入籼稻品种龙特甫B,PCR和Southern blot结果表明外源基因己整合到水稻基因组中,Western blot分析表明高赖氨酸蛋白质基因已在转基因水稻种子中表达。对7株转基因水稻种子的分析表明,蛋白质的含量（10.87%～13.16%）     

木薯干旱胁迫响应CC类谷氧还蛋白基因的筛选与体外表达分析

CC类谷氧还蛋白(CC-type glutaredoxins)是高等植物中所特有的一类谷氧还蛋白,模式植物中的研究表明,CC类GRX可以与TGA转录因子互作,在植物器官发育及响应环境胁迫过程中起重要的调控作用。基因差异表达分析结果表明,木薯中有多个CC类GRX基因在叶片中的表达受干旱胁迫的诱导。为了进一步研究木薯中CC类GRX蛋白与TGA的互作,本研究选择了其中的Me GRX058和Me GRX785这两个基因作进一步体外蛋白表达分析。理化性质及二级结构预测分析表明Me GRX058和Me GRX785蛋白分子量均在11 k D左右,具有谷氧还蛋白以及CC类谷氧还蛋白典型的结构域。通过构建酵母表达载体及植物表达载体,利用HA-Tag和GFP分别对Me GRX058和Me GRX785蛋白进行标记,在酵母和转基因木薯中进行表达,随后对融合蛋白的表达进行了Western blot检测。结果表明Me GRX058和Me GRX785成功在酵母和转基因木薯中表达,为进一步筛选它们的互作蛋白、研究其结构与功能做铺垫。     

以谷蛋白GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累

提高外源蛋白在特定目标组织器官中的表达量是转基因植物研究与开发的核心技术之一。谷蛋白是水稻种子中最主要的贮藏蛋白,其表达具有严格的时空特异性。为进一步研究谷蛋白信号肽序列在指导基因表达中的作用,本研究克隆了水稻谷蛋白Glu A-2基因的启动子及其信号肽编码序列,并与GUS报告基因编码区融合,构建了分别含有和不含有信号肽的表达载体p13GG和p13GSG;经农杆菌介导法分别转入同一水稻品种中,获得了20多个独立转化子,PCR证明外源基因都已整合进了水稻基因组中。Northern杂交结果表明,融合Glu A-2信号肽编码序列可显著提高GUS基因在水稻胚乳中的转录;利用GUS特异的抗体进行Western杂交分析,显示该信号肽序列可显著提高外源蛋白在转基因水稻胚乳中的积累,但是其所指导表达的GUS蛋白在水稻胚乳中并没有表现出相应的活性,其机制有待进一步深入解析。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白具有重要的指导作用。     

玉米小分子热激蛋白ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析

植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质POB21为材料,克隆了一个CDS序列长度为477 bp的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含158个氨基酸,具有HSP20蛋白典型的ACD结构域,预测的等电点为5.36,分子量为17.746 k D,被命名为Zm HSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因,进化和亚细胞定位分析表明,此基因属CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明,高温快速诱导Zm HSP17.7基因表达,15%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源ABA也不影响该基因的表达。与野生型拟南芥相比,超表达Zm HSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的高温和干旱耐受性,说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。     

玉米C2H2型锌指蛋白基因ZFP225的鉴定、生物信息学分析与克隆

使用生物信息学方法从玉米中预测并克隆了一个锌指蛋白基因,该基因定位于玉米7号染色体上,编码一个由219个氨基酸残基组成并且具有双锌指结构域的C2H2型锌指蛋白,分子量和等电点分别为22.53kDa和8.812。根据其编码蛋白分子量大小将其命名为ZFP225。ZFP225可能具有一个转录抑制活性的DLN-box,与植物中的C2H2型锌指蛋白具有较低的一致性,只在比较保守的锌指区具有相似性。进化分析表明,ZFP225与水稻锌指蛋白ZFP252亲缘关系最近,亲缘关系较近的锌指蛋白多参与植物的胁迫应答反应,而亲缘关系较远的蛋白多数参与调控植物的生长发育。使用RT-PCR方法,从玉米幼苗中成功克隆出了ZFP225基因。     

HvLBD19基因对大麦不定根发育的调控

植物LBD基因家族是植物特异的转录因子家族,在调控植物生长发育和氮素代谢方面起到重要的作用。基因组共线性分析表明,大麦(Hordeum vulgare L.) HvLBD19基因为水稻ARL1和玉米RTCS基因直系同源基因。基因时空表达分析结果表明,该基因在不定根中表达丰度最高,且受外源生长素诱导表达,所编码蛋白定位于细胞核内。转基因功能验证结果表明,苗期超表达株系相对于野生型不定根长度增长近1倍,不定根数目增加40%。本研究初步明确了HvLBD19基因影响大麦不定根发育,为进一步深入探究大麦HvLBD19基因调控不定根发育的分子机制提供了基础。     

大麦HvCPP转录因子家族的全基因组鉴定与分析

CPP (Cystiene-rich polycomb-like protein)转录因子是植物中一类较小的基因家族,在植物生长发育、激素信号转导和逆境胁迫响应中发挥调控作用。本研究通过对大麦基因组的系统分析,鉴定出7个HvCPP转录因子成员,且蛋白序列均包含2个典型的CXC结构域。系统进化分析表明大麦HvCPP分为2个大类和4个亚类,与水稻OsCPP进化关系较近。HvCPP转录因子家族成员亚细胞定位均在细胞核中。HvCPP基因启动子区域存在大量的生长发育相关元件、不同激素信号响应元件和逆境胁迫响应元件。转录组数据表明,HvCPP转录因子家族成员在大麦不同发育阶段的不同组织器官中存在特异性表达,不同成员在大麦相同组织器官中的表达水平差异显著。本研究表明大麦HvCPP转录因子家族可能在大麦生长发育、激素信号传导及逆境胁迫响应中发挥重要功能。     

高粱SbSBP15基因的克隆及分析

SBP-box (squamosa promoter binding protein, SBP)基因编码一类绿色植物特有的转录因子,它与器官大小的控制、株型、激素和逆境响应等植物重要发育过程密切相关。本研究克隆了高粱SbSBP15基因,对其进行了序列分析、系统进化分析及表达分析。SbSBP15基因编码一个由409个氨基酸组成的蛋白质,含有3个外显子和2个内含子,其SBP结构域位于96～165 aa区域;系统进化显示19个SBP15蛋白可分为4组(Ⅰ～Ⅳ),其中第Ⅰ～Ⅲ组内仅有单子叶植物蛋白,而第Ⅳ组中同时包含有单子叶植物蛋白和双子叶植物蛋白。Sb SBP15与玉米Ub2和Ub3关系最近;启动子序列分析表明,SbSBP15启动子的顺式作用元件包含逆境响应、组织特异性表达以及植物生长发育等相关元件;SbSBP15基因在花后10 d的种子中表达量最高,是苗期根部表达量的18倍;但是随着高粱种子不断发育,SbSBP15表达量逐渐降低,表明SbSBP15可能参与高粱种子发育的过程。本研究为进一步探索SbSBP15的生物学功能奠定了基础。     

苹果SnRK2基因家族的鉴定和生物信息学分析

SnRK2（蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2）是植物特有的一类Ser/Thr 类蛋白激酶,参与植物体内多种信号途径的转导,在植物逆境生理过程中扮演了重要的角色。本文利用隐马可夫模型搜索和系统建树的方法,在苹果基因组中鉴定出了16个SnRK2基因家族成员,然后从系统发生、理化性质、二级结构、motif、C末端序列和EST等方面对其进行了预测和分析,并分析了苹果与拟南芥、水稻、玉米等的SnRK2基因家族之间的关系。结果表明,苹果中鉴定的基因与拟南芥、水稻、玉米所有的SnRK2蛋白一起分成了3个亚族。系统发生、motif和C末端序列分析表明,苹果SnRK2蛋白激酶家族具有较高的保守性。本研究为苹果SnRK2基因家族生物学功能的研究奠定了生物信息基础。     

水稻(Oryza sativa L.)a-淀粉酶基因的进化及组织表达模式

α-淀粉酶在植物特别是谷类萌发种子淀粉降解中具有重要作用。水稻α-淀粉酶基因的结构、进化和表达研究已有报道,但是,多集中于OsAmy1和OsAmy3这两个亚族内基因间以及发芽种子中。不同亚族间的基因结构、进化及更多组织和时期的表达特点尚缺乏细致研究。本研究通过TblastN同源性比对及保守结构域分析揭示水稻基因组含有11个α-淀粉酶基因。生物信息学分析、系统进化树构建及半定量RT-PCR分析表明,该家族基因在结构上发生了明显的分化,具有清晰的进化层次,OsAmy5A和OsAmy4A是家族中较原始状态的基因;在表达和功能上也发生了明显分化,进化水平较高的基因发生了明显的时空表达特异性分化。OsAmy1A、OsAmy3A及OsAmy3D和OsAmy3E分别在保证种子植物世代传递、维持种子休眠过程中胚的微弱生命活动及保证种子萌发过程中能量的稳定持续供应上具有重要作用。     

玉米自交系B73全基因组NBS类型抗病基因分析

核苷酸结合位点(NBS)类型抗病基因是植物抗病基因中最大的一个类别,也是近年来植物抗病分子育种研究的一大热点。本研究对玉米自交系B73全基因组中含有NBS结构的候选抗病基因进行了基因总数、类型、系统进化关系等分析。在B73全基因组中含有165个NBS结构的基因,远远少于水稻中的同类基因,按照N-端结构和亮氨酸富集区(LRR)结构, 将其分为153个标准结构和12个非标准结构NBS基因。其中,标准结构基因又分为CC-NBS-LRR、CC-NBS、NBS、NBS-NBS、 NBS-LRR、NBS-NBS-LRR、NBS-X、X-NBS等8个类型。系统进化树分析表明,NBS类型抗病基因存在明显的两大分支,与水稻的星状发散型分布有很大差异。通过基因家族分析,还发现了玉米NBS类型基因的复制现象,但发生复制的基因比例低于水稻,可能是造成玉米NBS抗病基因数目较少的原因之一。     

玉米HSP90基因家族的全基因组鉴定与分析

热激蛋白90（HSP90）广泛参与生物体的生长发育,且积极响应多种非生物胁迫。为全面解析玉米HSP90基因家族信息,对HSP90基因家族进化树、基因结构、保守基序（motif）、GO富集和组织表达模式等进行分析,并进一步分析ZmHSP90-1基因响应干旱胁迫的表达模式及蛋白互作关系。结果显示,从玉米全基因组水平共鉴定到11个ZmHSP90家族基因,被划分为5个亚族（I~V）;相邻进化树分支上的ZmHSP90基因具有相似的motif和基因结构;GO富集分析显示,11个ZmHSP90基因均参与了蛋白质折叠过程;表达模式分析显示,11个ZmHSP90基因在不同组织或器官中均有表达,其中ZmHSP90-1基因的表达量相对较高;ZmHSP90-1基因在耐旱性强的玉米自交系中具有更高的表达量,且积极响应干旱和复水过程;蛋白互作预测显示,ZmHSP90-1可能与其互作蛋白协同响应非生物胁迫,发挥生物学功能。     

水稻抗坏血酸氧化酶基因家族生物信息学分析

抗坏血酸氧化酶(ascorbic acid oxidase,AAO)是多铜氧化酶家族中的一员,在植物生长发育过程中起重要作用。为深入研究水稻AAO基因家族的功能特征及表达模式,采用生物信息学从Phytozome的水稻数据库鉴定出14个AAO成员,并对其染色体定位、蛋白理化性质及二级结构、基因结构、保守基序、系统发生树和表达模式等方面进行预测分析。结果显示,14个OsAAO不均匀地分布在8条染色体上,多为碱性蛋白;蛋白二级结构以无规则卷曲为主要组成部分;基因结构和保守基序分析表明,OsAAO内含子数目变化差异较大,但氨基酸序列具有较强的保守性;系统发生树可分为3个亚家族,OsAAOs与玉米、高粱簇在一起,亲缘关系较近;另外表达模式分析发现,OsAAO在不同的组织部位表达水平具有差异,这表明其行使功能不同。这些结果为今后研究该基因家族的生物学功能和培育耐旱品种提供理论依据。     

玉米自交系B73全基因组NBS类型抗病基因分析

核苷酸结合位点(NBS)类型抗病基因是植物抗病基因中最大的一个类别,也是近年来植物抗病分子育种研究的一大热点。本研究对玉米自交系B73全基因组中含有NBS结构的候选抗病基因进行了基因总数、类型、系统进化关系等分析。在B73全基因组中含有165个NBS结构的基因,远远少于水稻中的同类基因,按照N-端结构和亮氨酸富集区(LRR)结构, 将其分为153个标准结构和12个非标准结构NBS基因。其中,标准结构基因又分为CC-NBS-LRR、CC-NBS、NBS、NBS-NBS、 NBS-LRR、NBS-NBS-LRR、NBS-X、X-NBS等8个类型。系统进化树分析表明,NBS类型抗病基因存在明显的两大分支,与水稻的星状发散型分布有很大差异。通过基因家族分析,还发现了玉米NBS类型基因的复制现象,但发生复制的基因比例低于水稻,可能是造成玉米NBS抗病基因数目较少的原因之一。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

菜豆TIFY基因的全基因组鉴定与系统进化分析

TIFY蛋白是植物特异性转录因子,在植物生长、发育和基因调控中具有重要作用。尽管部分菜豆TIFY基因被鉴定与研究,但从基因组水平剖析TIFY基因家族的研究未见报道。结合基因组和转录组学数据,本研究系统剖析了菜豆TIFY基因家族的序列、选择、表达及进化特征。结果显示:18个PvTIFY基因散落分布在9条染色体上,共线性鉴定出6对片段重复基因和1对串联重复基因,同时这些基因被分为6大类群;序列分析表明,菜豆TIFY基因有12种基因结构模式,但有5种保守基序组成模式,这说明保守基序模式更保守;选择压力检测显示,同源基因对均受到负选择作用,显示较高的保守性;表达分析揭示了菜豆TIFY家族基因具有多样化的表达模式,其中同源基因对表达模式发生趋异现象。这些结果为深入研究菜豆TIFY蛋白的生理功能提供了参考。     

茶树生长素外运载体基因CsPIN3的克隆与表达分析

从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛选拼接得到1条与其他植物PIN蛋白高度相似的EST序列,采用反转录PCR结合RACE技术从茶树中克隆到生长素外运载体基因PIN3的全长cDNA序列,命名为CsPIN3 (GenBank登录号为KP896474)。CsPIN3全长2654 bp,包含1926 bp的完整开放阅读框(ORF),编码641个氨基酸;生物信息学分析显示,CsPIN3编码的蛋白质分子量为70.15 kD,理论等电点为8.42,是一种非分泌性蛋白;亚细胞定位显示,CsPIN3主要分布于质膜上,在内质网中有少量分布,是典型的膜蛋白;氨基酸序列分析表明CsPIN3编码蛋白由两端的疏水区和中间的亲水区构成。疏水区内有多个跨膜螺旋,其中N端疏水区有5个跨膜螺旋,C端有4个,与水稻的PIN蛋白结构相似。亲水区存在2个可变结构域,还存在着糖基化位点和磷酸化位点以及调控PIN蛋白内吞作用的NPNXY保守内在构型(Inner Motif, IM),如PIN蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性位点--TPRXS(N/S)结构域;相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与杨树、葡萄、柑橘、烟草、番茄、马铃薯、和芝麻等植物的PIN序列相似性在80%以上,与茄科植物的亲缘关系最近。在拟南芥PINs蛋白中,AtPIN3与茶树CsPIN3的亲缘关系较近。组织表达特异性分析表明 CsPIN3在茶树根、茎、叶、花中均有表达,在花中的表达量较高,在茎、叶中的表达量略高于根部。实时定量PCR分析显示,CsPIN3在龙井43茶树越冬芽萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到膨大期之间),在茶芽萌动过程中表达上调的速度明显。推测该基因可能与茶树越冬芽休眠的维持和解除相关。     

调控蓝色大麦花青素合成代谢的MYC基因克隆及序列分析

本研究的目的是利用PCR方法克隆了大麦中MYC转录因子HvMYC1。研究结果表明:该基因全长1 668 bp,编码氨基酸555个,分子量为61 333.71,等电点为8.47,有两个属于bHLH超级因家族的保守区,该蛋白具有亲水性,二级结构以α-螺旋(40.90%)和无规则卷曲(41.44%)为主要部分,Hv MYC1蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。蛋白系统进化分析表明,HvMYC1基因与小麦、矮牵牛、水稻等物种中调控花青素合成MYC转录因子同源。本研究为解析蓝粒大麦中调控花青素合成代谢基因分子遗传机理提供科学依据,为大麦花青素的继续深入研究提供参考。