重组人胰岛素基因真核表达质粒的多聚酶链反应

目的：鉴定重组人胰岛素基因真核表达质粒。方法：应用多聚酶链反应鉴定重组人胰岛素基因真核表达质粒pCMV．Ins。结果：显示insulin基因已经插入重组基因中，人胰岛素基因真核表达质粒已成功构建。结论：已成功构建真核表达载体pCMV．Ins，为进一步进行胰岛素基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞，使之产生胰岛素的研究奠定了坚实的基础。     

小鼠CD40L基因的克隆与真核细胞表达研究

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组真核表达载体，并鉴定其在转染细胞中的表达。方法自活化的T细胞经RT-PCR得到小鼠CD40L的cDNA基因，将其克隆入真核表达载体pCMV—Myc，获得重组质粒pCMV—Myc／CD40L，酶切及测序鉴定；脂质体法转染CHO细胞，使用RT-PCR及流式细胞技术分别从mRNA和蛋白水平对CD40L的表达进行检测。结果将pCMV-Myc／CD40L真核表达载体转染CHO细胞，RT-PCR和流式细胞仪检测证实小鼠CD40L在真核细胞中暂态表达。结论成功地建立表达小鼠CD40L基因的重组真核表达载体，为进一步研究其生物学特性及肿瘤的基因治疗提供了基础。     

SEA和喉癌MAGE-A3基因重组真核共表达载体的构建和鉴定

目的构建超抗原SEA和喉癌来源的MAGE-A3基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达。方法分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位点的真核表达载体IRES序列的上、下游,构建成重组质粒pMAGEA3-IRES-SEA。经脂质体转染至293T细胞以后,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别鉴定SEA、MAGE-A3基因的表达。结果限制性内切酶酶切分析证实MAGE-A3基因和SEA基因均正确地克隆在pMAGEA3-IRES-SEA中,基因测序结果与GenBank公布的MAGE-A3、SEA序列完全一致,实现了双基因的正确重组。重组质粒转染293T细胞后能检测到MAGE-A3、SEA基因的高水平表达。结论成功地构建了pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3和SEA蛋白,由此奠定了其作为抗喉癌DNA疫苗应用的基础。     

TMSG-1蛋白不同功能域重组质粒构建及亚细胞定位

目的构建肿瘤转移抑制基因-1（TMSG-1）蛋白不同功能域重组质粒,并观察其亚细胞定位,探讨TMSG-1蛋白的转录活性。方法以pcDNA3-TMSG-1真核表达载体为模板,聚合酶链式反应（PCR）扩增TMSG-1基因全长及不同截短体片段,与带有Flag标签的真核表达载体pcDNA3连接,转化感受态细胞,氨苄青霉素筛选阳性克隆,提取质粒,酶切鉴定。用构建的TMSG-1基因各个截短片段的重组质粒转染Hela细胞,Western blot法鉴定蛋白表达。免疫荧光检测各个截短体亚细胞定位。结果 PCR成功扩增得到目的基因片段,并构建得到TMSG-1全长及不同截短片段T1（aa129-aa380）、T2（aa71-aa380）、T3（aa1-aa128）、T4（aa1-aa70）、T5（aa71-aa128）的真核表达载体,经酶切及基因测序鉴定序列完全正确。Western blot检测结果表明各重组质粒有预期长度的蛋白表达。免疫荧光检测结果表明,含有Homeodomain结构域的截短体T2、T3及T5能够入核,其中T2在核内弥漫分布,T3及T5主要定位于核仁。结论成功构建并表达了TMSG-1全长及不同截短片段的真核表达质粒,其中含有Homeodomain结构域的截短体定位于细胞核。     

重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

目的 构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法 聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pcDNA3．1（＋）/Tat中扩增tat基因,利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ,获得正向插入克隆（pSecT at ）和反向插入克隆（pSecTat-AS）,经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带,与预期的324 bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100％同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×10^3蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT 表达量高于反向克隆质粒转染细胞（P＜0．05）。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高（P＜0．05）。结论 成功构建 HIV-1 tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的T at蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。     

SV40T抗原荧光真核表达载体构建及在胰岛细胞中的表达

背景：有研究表明小鼠胰岛细胞永生化以后增殖能力明显增强，但功能减弱。然而，小鼠的端粒和人类的端粒有差别，大鼠的端粒与人类的相似。 目的：设计和构建SV40T荧光真核表达载体，导入大鼠胰岛细胞中进行表达鉴定。 设计、时间及地点：细胞观察实验，于2007—10／2008—04在深圳市人民医院中心实验室完成。材料：选用成年雄性SD大鼠2只；pCMV—SV40T质粒：pSC—A质粒：pIRES2-ZsGreen1质粒。 方法：用Not I和Xho I将SV40T片断从pCMV-SV40T质粒上双酶切下来，回收后克隆到载体pSC-A中成为pSC—SV40T，再用Xho I和Sac II将SV40T片断双酶切下来，回收后正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-ZsGreen1中，酶切鉴定重组质粒；用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的大鼠胰岛细胞；检测SV40T基因在胰岛细胞中的表达。 主要观察指标：绿色荧光蛋白的表达：SV40T的转录和翻译。结果：①经XhoI和SacII双酶切后，重组质粒被切成5.3 kb和2．4 kb 2个片段，与理论预期长度相符。②pIRES2-ZsGreen1—SV40T重组基因经脂质体法转染，G418筛选，在胰岛细胞内可见绿色荧光，反转录-聚合酶链反应及细胞免疫荧光染色可见SV40T mRNA转录及其蛋白的表达。 结论：实验成功构建了SV40T荧光真核表达载体，并可在大鼠胰岛细胞中表达。     

Pir-b基因慢病毒载体的构建和表达

本研究构建pir—b基N慢病毒载体并检测其在293T细胞中的表达。从小鼠的mRNA中钓取pir—b基因的开放阅读框,与测序载体连接,经过测序鉴定以后,构建含有pir—b基N的慢病毒穿梭质粒,与包装质粒一起共转染293T细胞,收获上清病毒浓缩纯化后转染293T细胞,用Western blot检测PIR—B蛋白的表达。同时以含有egfp基因的慢病毒作为转染效率的对照,结果表明：含有pir—b开放阅读框的慢病毒穿梭质粒构建成功,序列测定的结果与预期完全一致,含有pir-b的慢病毒载体包装成功。Western blot的结果证实外源PIB—B蛋白在293T细胞中正常表达。结论：本研究成功构建了含有pir—b基因的慢病毒载体,转染293T细胞以后正常表达PIR—B蛋白,这为以后深入研究pir—b在免疫调节中的作用奠定了坚实的基础,     

Smad家族蛋白在真核细胞中的表达

目的:探索Smad蛋白在肺部肿瘤形成过程中的分子机制,构建带FLAG标签的smad1、2、3、4的真核表达我体,并检测其在293T细胞中的表达.方法:以人肺细胞cDNA文库为模板.分别扩增smad1、2、3、4基因全长编码区序列,克隆到pCDNA3-FLAG真核表达载体上.用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染293T细胞,Western-blot法检测细胞中的FLAG融合蛋白的表达.结果:酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-smad真核表达载体,并都能在真核细胞中表达分子量大小相符的重组蛋白.结论:成功地构建了FLAG-smad1、2、3、4真核表逸载体,为Samd蛋白及其相关蛋白在肺部肿瘤的作用研究奠定了基础.     

大鼠组织因子基因克隆及其在C6细胞系中的表达

目的:克隆大鼠组织因子(tissue factor,TF)基因,构建真核表达载体pEGFP-N1-TF,转染C6大鼠神经胶质瘤细胞并检测转染细胞内TF表达水平.方法:采用RT-PCR法从Wistar大鼠肺组织中扩增TF基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1上.通过测序鉴定重组质粒中插入TF的完整性和可靠性.应用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转入C6细胞中,荧光显微镜下观察EGFP报告基因的表达强度和转染效率,并对转染细胞的TF-eGFP融合蛋白进行Western blot检测.结果:成功构建pEGFP-N1-TF真核表达载体,转染C6细胞24 h后,在荧光显微镜下可以观测到荧光,并通过Western blot技术检测到TF-eGFP融合蛋白的表达.结论:重组真核表达载体pEGFP-N1-TF构建成功,转染C6细胞后获得了良好的瞬时表达.     

携带人Gfi1基因重组慢病毒载体稳定转染32D细胞株的建立

本研究建立真核细胞表达的Gfi1基因重组慢病毒载体包装系统,并实现Gfi1在32D细胞中长期、稳定的表达,为进一步研究Gfi1基因在恶性血液病中的发生发展建立一个有效的平台。制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（pLOX—Gfi1／pLOX）、包装质粒（pCMVAR8．2）及包膜蛋白质粒（pMD．G）。用脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,48小时后收集病毒上清,并转染靶细胞32D;用Western—blot法检测293T及32D细胞中Gfi1的整合及表达。结果表明：慢病毒的3种质粒可以高效转染293T细胞,并成功包装出慢病毒。目的基因Gfi1能被重组慢病毒高效导入靶细胞32D,并稳定表达,在荧光显微镜下可直接观察到GFP。Western—blot能检测到Gfi1蛋白在包装细胞293T及32D细胞中的表达。结论：慢病毒介导的Gfi1基因可以高效稳定转染32D细胞并持续表达,证明本研究建立了一种有效的基因转移系统。     

小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达

本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）以C57BL／6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到10^8TU／ml。以重组慢病毒颗粒感染293Fr细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293Fr细胞表达CXCR4蛋白。结论：成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B的构建及在293T细胞中的表达

[摘要] 目的: 构建人基因PDGF-B真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B,并在293T细胞中进行瞬间表达。方法: 采用PCR方法从购自美国典型培养物保藏中心含有PDGF-B基因全长cDAN序列的质粒中扩增出PDGF-B的cDAN片段，并与真核表达载体pIRES-EGFP连接，双酶切鉴定，最后采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pIRES-EGFP-PDGF-B转入293T细胞中，利用荧光显微镜和Western blotting进行表达鉴定。结果: 成功克隆了PDGF-B基因全长cDAN，真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B被成功构建，双酶切鉴定正确，表达载体能在293T细胞内正确地表达成熟的PDGF-B蛋白，并可分泌到细胞外。结论: 成功构建了pIRES-EGFP-PDGF-B真核表达载体，为进一步利用PDGF-B对脊髓损伤进行基因治疗奠定基础。     

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的：构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法：双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体（Lenti-SOX9-GFP）,以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体（Lenti-LMP1-RFP）。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论：测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9（NM_000346）及LMP1（AF345904.1）基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。     

Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin 1基因是哺乳动物的自噬调控基因。目的：实验拟构建Beclin 1基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin 1后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin 1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin 1基因的过表达效率。结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin 1的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin 1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin 1基因慢病毒过表达载体。