亚麻籽降胆固醇活性肽的酶解工艺优化及分级制备

以亚麻籽分离蛋白为原料,利用酶解工艺制备降胆固醇活性肽。对蛋白酶进行了筛选,并通过单因素实验和正交实验确定最优酶解工艺,采用超滤分离技术得到具有较高降胆固醇活性的亚麻籽肽,并对超滤前后亚麻籽肽的氨基酸组成及降胆固醇活性进行了研究。结果表明:最佳酶解工艺条件为采用Protease M进行酶解、加酶量1. 5%、底物质量分数2. 0%、酶解温度50℃、酶解时间3 h,在此条件下亚麻籽肽的降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达53. 19%;超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达72. 39%,较超滤前提高了19. 20个百分点。氨基酸分析结果表明,超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分的总疏水性氨基酸含量明显高于超滤前,提高了15. 97个百分点,而且多肽组分中赖氨酸/精氨酸的比值低于超滤前,这可能是其降胆固醇活性强于超滤前的主要原因。     

黑豆肽的分离纯化及其辅助降血脂作用

采用DA201-C大孔树脂吸附和乙醇分级洗脱的方式,对黑豆蛋白酶解液进行分离纯化,通过体外模拟实验测定分析不同体积分数乙醇洗脱的黑豆肽分级组分对胆固醇胶束溶解度的抑制率,选择对胆固醇胶束溶解度抑制率最强的黑豆肽组分进行辅助降血脂动物实验。结果表明:黑豆肽分级组分的平均疏水性值随着洗脱乙醇体积分数的增大而递增,其中乙醇体积分数为75%时洗脱得到的组分对胆固醇胶束溶解度的抑制率最高,该组分添加量为5g/L时,其抑制率为62.1%;对小鼠灌胃剂量为1000mg/(kg.d)时,黑豆肽对高血脂小鼠血清中总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)+极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)浓度降低极为显著(P<0.01)。提示黑豆肽具有一定的辅助降血脂功效。     

凝胶过滤色谱纯化乳清蛋白降胆固醇肽的研究

从乳清蛋白水解物中纯化降胆固醇活性肽,乳清蛋白经胰蛋白酶水解得到的水解物经超滤粗分离,采用凝胶过滤色谱分离纯化,并对其洗脱流动相种类、pH值和洗脱液浓度进行优化筛选,采用体外检测方法筛选出最佳洗脱条件下的具有胆固醇胶束溶解度抑制活性最高的组分,并用已知分子量的标准蛋白质凝胶层析绘制校正曲线,建立分子量的对数与出峰时间的关系。结果表明,优化的最佳洗脱液为磷酸钠溶液,研究得到了凝胶过滤色谱的校正曲线,在洗脱时间为71 min时得到的组分降胆固醇活性最高,为57.48%,经计算其分子量在2 000~4 700 u范围内。     

蚕豆蛋白酶解物分离纯化及降胆固醇活性

采用凝胶过滤色谱对经过大孔吸附树脂纯化的蚕豆蛋白酶解物进行分离纯化,以期得到高降胆固醇活性的酶解物组分。结果表明:单因素试验得到蚕豆蛋白酶解物凝胶过滤色谱最佳分离纯化工艺条件为Sep G-10、G-25葡聚糖凝胶为柱填充材料,10 mg/m L的酶解液上样量4 m L,洗脱剂为去离子水,洗脱流速1 m L/min。凝胶过滤色谱分离纯化后得到F1~F6 6个蚕豆蛋白酶解物组分;与10 mg/m L考来烯胺散阳性对照比较,F3、F6组分对3种胆酸盐(胆酸钠、甘氨胆钠酸、牛磺胆酸钠)抑制率均高于阳性对照,其中F6组分的相对抑制率最高,分别为(274.98±0.19)%、(140.22±0.20)%、(130.99±0.22)%。     

大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化

研究了大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化,用Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白得到的酶水解物经过大孔吸附树脂脱盐,并用不同浓度的乙醇以疏水性大小洗脱,得出浓度为75%的乙醇洗脱物具有最高的降胆固醇活性,将此洗脱物再经过SephadexG15凝胶过滤色谱进行分子量分级,得到了部分纯化的大豆降胆固醇肽,其最高降胆固醇活性肽是分子量大多在1000以下的小肽,抑制率为81.26%。     

酪蛋白源降胆固醇肽的酶解制备工艺优化

以酪蛋白为原料,采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及胰蛋白酶对酪蛋白进行水解,确定制备降胆固醇肽的最佳蛋白酶;通过单因素实验和响应面试验,研究水解pH、水解温度、酶与底物比、底物浓度和水解时间对酪蛋白水解度和胆固醇胶束溶解度抑制率的影响,确定最佳水解条件;而后通过超滤和凝胶过滤层析确定降胆固醇肽的初步分离工艺。结果表明:制备酪蛋白源降胆固醇肽的最佳水解工具酶是中性蛋白酶,其最佳酶解条件为反应温度51.3 ℃,酶与底物浓度比6.47%,pH6.34,底物浓度5 g/100 mL,反应时间3.5 h,胆固醇抑制率为58.25%±0.59%;Sephadex G-10分离酪蛋白降胆固醇肽条件为上样浓度80 mg/mL,上样体积2.5 mL,洗脱速度3.5 mL/min;经酶解、超滤及层析后制备的酪蛋白源降胆固醇肽峰1和峰2样品在100 μg/mL的胆固醇溶解度抑制率为24.2%±0.24%和4.3%±0.16%。经酶解制备分离后,获得具有抑制降固醇胶束溶解活性的降胆固醇肽,为降胆固醇肽的开发提供理论研究基础。     

鲫鱼蛋白酶解制取鱼露及其降胆固醇活性研究

以鲫鱼为原料,利用蛋白酶解技术制取富含多肽的酶解物,并以酶解物为基本原料制备调味品鱼露。通过对胆固醇胶束溶解度的抑制作用,研究其降胆固醇的活性。结果表明,最佳酶解条件为时间5.40h,加酶量109.67U/mL,温度40.23℃,此时胆固醇胶束溶解度抑制率为53.129±0.670%,与预测值54.617±0.240%相吻合。在此条件下,制得的鱼露风味佳、营养高,且具有较好的降胆固醇活性。     

酶解燕麦蛋白制备ACE抑制肽的研究

本研究以燕麦蛋白为原料,分别选用Alcalase、Neutrase 和Protamex 进行单独或联合水解,经活性炭YD-303脱色、大孔吸附树脂DA-201C Ⅱ脱盐及分级纯化、Sephadex G-25 凝胶色谱柱进一步分离,以获得高纯度、高活性的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。结果表明：单酶反应时,Alcalase 水解2h所获得的产物对ACE 的抑制率可达85.40%;YD-303 处理燕麦蛋白酶解液脱色最优工艺为添加量1.5%(W/V)、pH3.5、温度40℃、脱色时间75min。利用75% 乙醇洗脱大孔吸附树脂DA-201C Ⅱ所获得的组分ACE 抑制活性最高,其经Sephadex G-25 进一步分离纯化,得到四个分离组分,第四组分的ACE 抑制活性最高,抑制率为95.6%。     

亚麻籽巯基肽的制备及富集北大核心CSCD

天然巯基化合物因生理活性高、毒副作用低等优势越来越受到关注。为获得天然巯基肽,以低温压榨亚麻籽饼为原料提取亚麻籽蛋白,进一步酶解制备富含巯基的亚麻籽蛋白酶解物,并采用共价色谱法富集亚麻籽巯基肽。首先对蛋白酶进行了筛选,然后以酶解温度、pH、酶解时间、酶添加量、料液比为考察因素,以巯基含量为评价指标,在单因素实验的基础上通过正交实验对酶解工艺进行优化。采用Thiopropyl Crystarose 6 Fast Flow凝胶对亚麻籽蛋白酶解物中巯基肽进行选择性吸附并洗脱收集,并对亚麻籽巯基肽的氨基酸组成进行了分析。结果表明:最佳酶解工艺条件为采用木瓜蛋白酶、料液比1∶60、pH 7.0、酶解温度55℃、酶添加量3%、酶解时间4 h,在此条件下亚麻籽蛋白酶解物的巯基含量为16.69μmol/g;通过富集得到巯基含量为71.13μmol/g的亚麻籽巯基肽;相较于亚麻籽蛋白,亚麻籽巯基肽中含巯基氨基酸比例升高。综上,以低温压榨亚麻籽饼为原料,通过蛋白提取、酶解和共价色谱法富集可得到亚麻籽巯基肽。     

罗非鱼肌浆蛋白源抗氧化肽的制备、分离纯化及其体外抗氧化活性

采用木瓜蛋白酶对罗非鱼肌肉蛋白组分（肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白）进行酶解,研究罗非鱼不同蛋白组分酶解产物的抗氧化活性,并通过超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对高活性肌浆蛋白组分抗氧化肽进行分离纯化,同时对纯化后的抗氧化肽氨基酸组成予以分析。结果表明：罗非鱼肌浆蛋白酶解物（tilapia sarcoplasmic protein hydrolysates,TSPH）抗氧化活性高于肌质与肌原纤维蛋白酶解物,当肌浆蛋白酶解4 h时,TSPH（6 mg/mL）对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、羟自由基清除率及其还原力均达到最高,分别为84.61%、50.01%和0.629;经超滤分离后,其分子质量小于5 kDa的组分具有较高的抗氧化活性;该组分经凝胶色谱分离后,富集得到E1～E4共4 个组分,其中E3组分（0.8～0.3 kDa）的抗氧化活性最高, 3 mg/mL E3组分对DPPH自由基清除率达83.61%,还原力为0.953;E3组分再经反相高效液相色谱分离纯化后,富集得到F1～F9共9 个组分,其中F4组分的抗氧化活性最高,其DPPH自由基的半清除质量浓度为0.78 mg/mL,且经氨基酸组成分析发现色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）为其含量较高的氨基酸,相对含量分别高达31.20%、27.25%和8.97%。