夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

青天葵ISSR-PCR体系优化及引物筛选

目的:建立适合青天葵遗传差异分析的简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链式(PCR)反应体系。方法:采用正交试验设计对影响青天葵ISSR-PCR反应体系的5种因素(dNTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶)4个水平进行优化,并结合新复极差法,对试验中各单因素进行分析。结果:确立了青天葵最佳反应体系,即在20μL的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μL,dNTP 225μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA60 ng;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的青天葵ISSR-PCR反应体系,经过24份青天葵样品检验,得出该体系稳定可靠,可用于青天葵遗传差异分析。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化

目的建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化。结果采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 250μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L。结论建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.     

濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立

目的对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序进行优化,并将其应用于野生三叶青种质资源的遗传分子标记。方法采用单因素试验,对三叶青ISSR-PCR反应条件中的Mg2+、d NTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选,之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的ISSR引物。结果建立了ISSR-PCR最佳反应体系,为25μL反应体系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25mmol/L d NTP、50 ng DNA模板、0.5U Taq DNA聚合酶,并利用U810等16条引物,初步构建了15份三叶青种质资源的ISSR指纹图谱,平均多态条带百分率达57.0%。结论该反应体系的稳定性和多态性良好,可满足对三叶青野生资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。     

对叶百部基因组DNA提取及ISSR-PCR体系优化

目的建立适合对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR最佳反应体系。方法通过改良的CTAB法提取对叶百部基因组DNA,并采用正交试验设计方法对影响ISSR-PCR反应体系的5种因素(d NTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq聚合酶)4个水平进行正交试验,优化ISSR-PCR反应体系。结果确立了对叶百部最佳反应体系,即在20μl的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μl,d NTP 175μmol/L,Mg2+1.7mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 15ng。结论建立并优化了对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物。方法利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测最佳退火温度。结果首次建立了云南沉香ISSR-PCR的最佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、d NTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的最佳退火温度为53.0℃。并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础。     

穿龙薯蓣ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

目的建立穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的稳定体系。方法利用单因素及正交试验设计的方法对影响穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增效果的d NTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量Taq DNA聚合酶用量、Mg~(2+)浓度进行优化。结果穿龙薯蓣的ISSR-PCR的20μl最佳反应体系为:2.0μl 10×Taq Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.225mmol/L d NTPs,1.5 UTaq DNA聚合酶,1.0μmol/L引物,2.0 ng/μl DNA模板,dd H2O补齐。应用该反应体系筛选出来适用于穿龙薯蓣ISSR扩增的12条引物,并确定了各引物的最佳退火温度。结论确立了一个适用于穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的体系。