子宫内膜异位症相关微小RNA的研究进展

微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年来子宫内膜异位症研究的新方向。相关mi RNA的研究通过对比异位内膜组织和正常内膜组织mi RNA的表达差异,得到一些可能参与子宫内膜异位症发生发展的mi RNA。通过对某些特异性表达的mi RNA研究发现,mi RNA可能通过调控靶基因的表达调节异位内膜细胞的侵袭和增殖,比如mi R-let-7b、mi R-199a、mi R-10b通过直接或者间接调节MMPs的表达,从而影响异位内膜细胞的侵袭性;mi R-17-5p和mi R-23a/b可通过调节雌激素的合成促进异位内膜细胞的增殖。此外,mi RNA和子宫内膜异位症相关性不孕的发生也存在密切的关系。     

非编码RNA H19在二苯甲酮-3抑制绒毛外滋养层细胞增殖中的作用

目的研究二苯甲酮-3(benzophenone-3,BP-3)对绒毛外滋养层(HTR-8/Svneo)细胞的H19及mi R-675 m RNA表达的影响,并探讨非编码RNA H19在BP-3抑制HTR-8/Svneo细胞增殖中的作用。方法将处于对数生长期的HTR-8/Svneo细胞分别暴露于含终浓度为0(溶剂对照)、0.01、0.1、1 mg/L BP-3的培养基或转染试剂(脂质体2000和mi R-675抑制剂或H19抑制剂)中培养24 h。采用Real-time PCR检测H19、mi R-675 m RNA的表达水平;CCK-8法检测HTR-8/Svneo细胞的存活率。结果与溶剂对照组相比,1 mg/L BP-3染毒组HTR-8/Svneo后H19及mi R-675的表达水平均降低,差异均有统计学意义(P0.01);且随着BP-3染毒剂量的升高,HTR-8/Svneo细胞的H19及mi R-675的表达水平均呈下降趋势。与抑制剂对照组相比,加入H19抑制剂后HTR-8/Svneo细胞的存活率和mi R-675 m RNA的表达水平均降低;加入mi R-675抑制剂后HTR-8/Svneo细胞的存活率均降低,差异有统计学意义(P0.01)。结论 H19通过mi R-675在BP-3抑制HTR-8/Svneo细胞增殖中的发挥作用。     

N-Ras基因靶向的shRNA抑制二羟环氧苯并芘诱导的恶变细胞增殖

目的用小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默N-Ras基因表达,探讨N-Ras基因表达对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化人支气管上皮细胞(16HBE-T)恶性性状的影响。方法将已建立的针对N-Ras基因的shRNA干扰表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566转染16HBE-T细胞,经G418筛选,建立稳定沉默N-Ras基因转化细胞系。采用Western blot筛选最佳N-Ras基因沉默细胞系,用流式检测N-Ras沉默细胞周期变化,用软琼脂实验和裸鼠成瘤实验进行细胞表型分析。结果成功培养出稳定沉默N-Ras基因的16HBE-T细胞系,Western blot显示N-Ras蛋白抑制率最高达86%。流式分析发现稳定沉默N-Ras基因表达诱导转化细胞G0/G1期捕获,软琼脂实验和裸鼠成瘤实验发现稳定沉默N-Ras基因降低了体外恶性转化细胞的集落形成率、抑制了体内肿瘤细胞生长。结论N-Ras基因沉默可以降低转化细胞的细胞周期进程和细胞恶性性状表型,提示N-Ras基因在二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变过程中具有重要作用。     

石棉暴露人群血浆中差异microRNA筛选及功能分析

目的探讨石棉暴露对接触人群血浆micro RNA(mi RNA)表达的影响。方法选取暴露组(暴露年限10年)和对照组(未暴露)各3人,用mi RNA芯片比较两组对象血浆mi RNA表达差异,使用Target Scan、mi Randa和Pic Tar 3种在线软件对差异表达mi RNA进行靶基因预测,最后对靶基因进行基因本体论分析和全基因组及代谢途径数据库通路分析。结果 mi RNA芯片筛测结果显示,石棉暴露人群血浆中40个mi RNA的表达与对照组存在差异(P0.05),其中有9个mi RNA信号值500。对这些信号值500的mi RNA的靶基因进行预测和通路分析,有5个mi RNA检索到相应的靶基因,这些基因主要参与肿瘤相关的信号通路和代谢通路,包括FGFR3等潜在功能靶点。结论石棉暴露可致接触人群血浆中mi RNA发生差异表达,其靶基因主要参与肿瘤相关的信号通路,但其在石棉相关疾病中的作用机制有待进一步研究。     

circRNA002144在PM_(2.5)诱导人正常支气管上皮细胞炎性反应中的机制研究

目的研究circRNA002144在PM_(2.5)暴露人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的表达及其下游靶基因的差异表达情况,并探讨circRNA002144在PM_(2.5)诱导BEAS-2B细胞发生炎性反应中可能的调控机制。方法分别以0、30、60、90、120、150μg/ml的PM_(2.5)暴露BEAS-2B细胞48 h,收集细胞上清液用酶联免疫(ELISA)实验检测白细胞介素-6(IL-6)的分泌量;收集细胞,以Trizol试剂裂解细胞后提取总RNA,以实时定量PCR(q RT-PCR)检测不同浓度PM_(2.5)染毒BEAS-2B细胞中circRNA002144表达水平的变化;然后利用RegRNA和Target Scan预测与circRNA002144相互作用的miRNAs以及靶向的下游mRNA,选择炎症相关的mRNA进一步检测。结果与对照组相比,不同浓度的PM_(2.5)染毒组BEAS-2B细胞炎性细胞因子IL-6的表达均升高,且有剂量依赖关系;circRNA002144的表达水平均升高,且随着PM_(2.5)染毒浓度的增加呈高表达,在120μg/ml染毒组,相对表达量增高4.79倍,差异均有统计学意义(P0.01);结合生物信息学预测分析和q RT-PCR检测发现,相比于对照组,与circRNA002144相互作用的hsa-mi R-608和hsa-mi R-92a-2-5p在PM_(2.5)染毒组细胞呈现低表达的趋势,这两个miRNAs共同靶向的STAT3则呈现高表达,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 circRNA002144在PM_(2.5)诱导BEAS-2B细胞发生炎性反应中可能发挥促炎的作用,可能通过下调hsa-mi R-608和hsa-mi R-92a-2-5p促进IL-6分泌,进而激活STAT3炎症通路。     

金属镉应答新基因TEF-1δ的致癌力鉴定

目的 前期研究已发现金属镉应答新基因TEF-1δ转染NIH3T3细胞可致其编码蛋白质表达升高而引起细胞转化.本研究的目的是对TEF-1δ基因转化NIH3T3细胞的致癌能力和致瘤性进行鉴定.方法软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤实验.结果所有4株不同的TEF-1δ转染发生转化的NIH3T3细胞在软琼脂培养中均显示锚非依赖性生长能力,形成明显的细胞集落.而非转化对照细胞在软琼脂上则无生长能力.转化细胞和对照细胞分别给裸鼠皮下注射(每组4只,5组共20只),1周后,转化细胞组的绝大部分裸鼠下背部皮下开始出现肿瘤,4周后所有4种不同转化细胞株接种的裸鼠全部长出大小不等的肿瘤,但非转化对照细胞于第5周后仍无一只裸鼠出现肿瘤.提示TEF-1δ转基因转化细胞属恶性转化细胞,具有明显的致癌能力和致瘤作用.结论根据本研究结果及前期发现,可以认为新发现的TEF-1δ是一个镉应答原癌基因.     

TIF3镉应答基因的致癌性

[目的 ]前期研究发现 ,镉相关新基因TIF3 (基因文库添码 :AF2 710 72 )转染NIH3T3细胞可致其编码蛋白质表达升高而引起细胞转化。本研究的目的是对TIF3基因转化NIH3T3细胞的致癌能力和致瘤性进行鉴定。 [方法 ]软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验。 [结果 ]所有 4株不同的TIF3转染的NIH3T3细胞在软琼脂培养中均显示锚非依赖性生长能力 ,形成明显的细胞集落。而非转化对照细胞在软琼脂上则无生长能力。转化细胞和对照细胞分别给裸鼠皮下注射 (每组 4只 ) ,4周后所有接种转化细胞的裸鼠全部长出大小不等的肿瘤 ,但非转化的对照细胞于第 5周后仍无 1只裸鼠出现肿瘤。提示TIF3转基因转化细胞属恶性转化细胞 ,具有一定的致癌能力和致瘤作用。 [结论 ]根据本研究结果及前期发现 ,可以认为新发现的TIF3是一个镉应答原癌基因     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化研究

目的 研究潜在致癌化学物甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱发人支气管上皮细胞恶性转化的作用.方法 分别采用1、2、4、8μg/ml浓度的GMA多次处理人支气管上皮细胞(16HBE),连续动态地观察细胞形态学的改变,通过刀豆凝集素A(conA)试验、软琼脂集落形成试验、电镜扫描和裸鼠体内致瘤性试验观察细胞的恶性转化表型,并运用免疫化学方法对细胞和肿瘤组织来源特性进行鉴定.试验同时设二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组和三甲基胆蒽(MCA)阳性对照组.结果 1～8 μg/ml浓度范围的GMA多次攻击可使16HBE细胞发生恶性转化,转化率随染毒剂量的增加而升高,其中8μg/ml染毒组的转化率(8.48×10-6)与对照组(4.5×10-7)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞失去接触抑制呈交错重叠生长并能在软琼脂上形成集落,各剂量组的集落形成率随染毒剂量的增加而升高,其中2、4、8μg/ml染毒组的集落形成率分别为1.20‰、2.35‰和5.70‰,与溶剂对照组(0.30‰)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞对conA的凝集敏感性增加,扫描电镜下细胞表面微绒毛增多、变粗、变长.将转化细胞接种于裸鼠皮下可形成肿块,经病理组织学检查诊断为鳞状上皮细胞癌.16HBE细胞和肿块组织经免疫组织化学检测角蛋白呈阳性表达.结论GMA可在体外诱发16HBE细胞发生恶性转化.     

NiCl2诱导人支气管上皮细胞系恶性转化的研究

目的 建立NiCl2诱导永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiCl2诱导16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒，每隔20d染毒1次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成试验和裸鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiCl2多次处理，16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量一反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论NiCl2具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导恶变细胞中miR-494和miR-22的功能及PTEN的表达

目的分析反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化人支气管上皮细胞第30代(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15)miR-494及miR-22的表达水平,探讨其在化学致癌过程中的作用及对靶基因PTEN抑癌基因的调控。方法以16HBE-T30和16HBE-T15细胞为实验组,溶剂处理组分别为其相应的对照组细胞(16HBE-N30和16HBE-N15),用茎环结构逆转录引物定量RT-PCR检测四组细胞miR-494及miR-22成熟体表达水平。运用定量RT-PCR和Western blotting分别检测四组细胞PTEN mRNA和蛋白表达水平。运用miRNA前体及抑制剂对miNRA表达进行调控后,再检测PTEN的表达改变,并进行报告基因信号改变、细胞凋亡、软琼脂集落形成率等分析。结果 16HBE-T30中miR-494和miR-22表达水平分别是16HBE-N30的12.6和2.3倍,而16HBE-T15中miR-494、miR-22表达水平较16HBE-N15下降。16HBE-T30中PTEN蛋白表达量低于16HBE-N30。与前体阴性对照组相比,上调的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量降低至0.8和0.5倍,而降低的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量上调至1.3和1.5倍。在16HBE-T30细胞中,miR-494和miR-22表达下调均增强caspase-3/7活力,miR-494和miR-22表达上调则减弱其活力。miR-494和miR-22下调能够降低转化细胞的恶性程度。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-494和miR-22在转录后水平反向调控靶基因PTEN的表达,这两种miRNA在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。     

室间隔缺损microRNA相关调控基因的初步研究

目的通过筛选室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)患者和正常对照组血清差异micro RNA(mi RNA),应用生物信息学方法预测VSD相关易感基因,为VSD的临床诊断和治疗提供理论依据。方法于2014年9月—2015年12月,采用mi RNA表达谱芯片技术在济南市儿童医院心外科取样并筛选VSD患者和正常对照组血清mi RNA差异表达情况,预测调控靶基因,经基因富集分析(gene ontology analysis,GO)和基因通路分析筛选候选基因。结果通过mi RNA芯片技术共获得36个差异表达mi RNAs,预测得到靶基因447个,新的VSD易感基因7个。文献挖掘发现这7个基因在心脏发育过程中均起着极其重要的作用。结论通过生物信息学分析发现差异mi RNA调控的7个靶基因可能与VSD密切相关,提示该病的发生是多基因相互作用的结果,为后续深化该病机制研究提供了有效的指导。     

microRNA对A549细胞TGF-β1/ERK信号通路的调控

目的观察目标micro RNA对博来霉素诱导的A549细胞TGF-β1/ERK信号通路的调控作用。方法构建mi R-16、mi R-21、mi R-29a、mi R-155、mi R-200c、mi R-204、mi R-206过表达慢病毒载体,感染A549细胞后用博来霉素刺激,采用Real time-PCR和Western blot方法检测TGF-β1、ERK、AKT和p38表达情况。结果 Real time-PCR和Western blot检测结果显示,mi R-200c过表达慢病毒能够降低博来霉素刺激的A549细胞中TGF-β1、ERK、AKT和p38的表达(P0.05)。结论 mi R-200c能够降低A549细胞TGF-β1/ERK信号通路相关基因的表达,为进一步研究mi R-200c调控TGF-β1/ERK信号通路的分子机制奠定实验基础。     

硫酸镍对永生化人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的 建立硫酸镍(NiSO4)对永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiSO4对16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒一次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成实验和棵鼠体内致瘤实验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiSO4多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内形成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞瘤。结论 NiSO4具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

反义TIF3逆转镉转化BALB/c-3T3细胞的致癌性

为探讨反义TIF3能否逆转镉转化细胞的致癌性 ,用磷酸钙介导转染法和G418细胞筛选技术 ,建立CdCl2 转化BALB c 3T3细胞反义TIF3稳定表达系统 ,再用软琼脂检测和裸鼠致瘤试验对这些转基因细胞的致癌性逆转情况进行鉴定。结果显示CdCl2 转化BALB c 3T3细胞中反义TIF3表达可逆转这些细胞的转化表型 ,与非转染细胞和载体转染对照细胞比较 ,转染反义TIF3的镉转化细胞在软琼脂上所形成的锚非依赖性生长集落减少 2 5 %～ 70 %。转染反义TIF3基因的镉转化细胞可延迟裸鼠出现肿瘤的时间 ,而且这些肿瘤的大小显著变小 ,肿瘤重量平均下降 5 0 8%～ 5 5 1%。提示反义TIF3mRNA表达可逆转镉转化细胞的致癌性 ;应用反义TIF3阻断TIF3癌基因表达对镉诱发的肿瘤可能有治疗价值     

金属镉应答新基因TEF-1β的致癌力鉴定

目的 前期研究已发现金属镉应答新基因TEF-1β转染NIH3T3细胞可致其编码蛋白质表达升高而引起细胞转化。本研究的目的是对TEF-1β基因转化NIH3T3细胞的致癌能力和致瘤性进行鉴定。方法软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤实验。结果所有4株不同的TEF-1β转染发生转化的NIH3T3细胞在软琼脂培养中均显示锚非依赖性生长能力，形成明显的细胞集落。而非转化对照细胞在软琼脂上则无生长能力。转化细胞和对照细胞分别给裸鼠皮下注射(每组4只，5组共20只)，1周后，转化细胞组的绝大部分裸鼠下背部皮下开始出现肿瘤，4周后所有4种不同转化细胞株接种的裸鼠全部长出大小不等的肿瘤，但非转化对照细胞于第5周后仍无一只裸鼠出现肿瘤。提示TEF-1β转基因转化细胞属恶性转化细胞，具有明显的致癌能力和致瘤作用。结论根据本研究结果及前期发现，可以认为新发现的TEF-1β是一个镉应答原癌基因。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对微囊藻毒素染毒小鼠肝细胞抗氧化酶表达的影响

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对微囊藻毒素(MC-LR)染毒小鼠肝细胞抗氧化酶的影响。方法60只SPF级雄性昆明小鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组(简称对照组,生理盐水灌胃)、MC-LR染毒组(10μg/kg)、EGCG低(10 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高剂量(50 mg/kg)干预组,每组10只。各干预组整个实验期给予不同浓度的EGCG灌胃,自第11天起各干预组给予MC-LR 10μg/kg腹腔注射,每日一次,持续21 d。以RT-PCR检测小鼠肝细胞相关抗氧化酶m RNA表达水平,以免疫组化法检测相应蛋白表达水平。结果与对照组相比,MC-LR染毒组SOD、GPx和GST的m RNA和蛋白表达明显受抑制,差异有统计学意义(P0.05);与MC-LR染毒组比较,中、高剂量EGCG干预组SOD、GPx和GST m RNA与蛋白表达上升,差异有统计学意义(P0.05)。结论 EGCG可逆转MC-LR所致SOD、GPx和GST基因和蛋白表达降低,从而在一定程度上保护肝脏免受MC-LR的损伤。     

多囊卵巢综合征与相关微小RNA的研究进展

微小RNA(mi RNAs)是一组小分子非编码RNA,在转录后水平调控基因的表达。mi RNAs水平与糖尿病、胰岛素抵抗相关;多囊卵巢综合征(PCOS)患者外周血以及卵泡液中存在某些mi RNAs,提示mi RNAs可能作为PCOS相关的潜在生物标志物。研究发现,PCOS肥胖患者血清mi R-21、mi R-27b、mi R-103和mi R-155这4种mi RNAs的表达明显增加;而mi R-222、mi R-146a和mi R-30c这3种mi RNAs具有作为PCOS的血清生物标志物的某种可能性。卵泡液表达丰富的成熟mi RNAs,PCOS患者卵泡液中mi R-132和mi R-320表达显著低水平;mi R-224、mi R-376a和mi R-143这3种mi RNAs也可能作为PCOS病理生理机制研究的靶标。由于PCOS的异质性,不同研究得到的mi RNAs表达谱也不完全相同,所以对与PCOS相关的mi RNAs尚需进一步研究。     

石英诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的 研究石英诱发永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化作用.方法 用新研磨的浓度为300 mg/L的石英染毒16HBE细胞共10次,软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验鉴定转化细胞的恶性程度.结果 细胞培养至35代,发现石英可以诱导16HBE发生恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01);转化细胞在裸鼠体内成瘤.结论 石英具有较强的诱导16HBE恶性转化能力.     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的研究氯化镉诱发SV40 LargeT抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用。方法体外用不同浓度氯化镉多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度。结果细胞培养至35代,发现氯化镉可诱导16HBE恶性转化。转化细胞排列紊乱、重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01),并呈时间—剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论氯化镉有较强的诱导16HBE恶性转化能力;该转化模型为镉致癌机制的分子水平提供了理想的研究系统。     

血浆miR-451水平与子宫内膜异位症的关系

目的:探讨血浆微小RNA451(mi R-451)与子宫内膜异位症(EMs)的关系,并观察mi R-451对体外培养的子宫内膜基质细胞的增殖和迁移的作用。方法:选取2014年1月—2015年5月于深圳市罗湖区人民医院就诊的EMs患者(EMs组)54例,正常对照组59例,采血并提取血浆总RNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time q PCR)检测血浆mi R-451的表达强度。通过CCK-8实验检测mi R-451对异位子宫内膜基质细胞增殖的调控作用;采用损伤愈合实验探讨过表达mi R-451后异位子宫内膜基质细胞的迁移变化。结果:EMs患者血浆mi R-451表达水平低于对照组[(0.53±0.14)vs.(1.00±0.20),t=14.50,P<0.01];过表达mi R-451后EMs基质细胞的相对迁移活性下降[(1.00±0.12)vs.(0.74±0.02),t=4.73,P=0.001]。结论:EMs患者血浆mi R-451水平减低;mi R-451可能通过抑制异位内膜基质细胞增殖和迁移发挥作用。