靛玉红抗斑马鱼胚胎血管生成活性机制研究

目的:研究靛玉红抗血管生成作用及相关机制。方法:以tgfli1:eGFP(+/-)斑马鱼为模型,实验分空白对照组、二甲基亚砜组、靛玉红组(15μM、30μM、90μM)、阳性SU5416对照组,在12hpf时加药,于48hpf时在荧光显微镜下观察其体节间血管生成情况,并进行定量分析。运用整体原位杂交的方法和RT-PCR技术检测flk1基因的表达情况。结果:与空白对照组相比,靛玉红各浓度组体节间血管长度有显著性差异(P<0.01),并呈剂量依赖性抑制;与空白对照组相比,靛玉红对斑马鱼胚胎flk1mRNA表达有明显抑制作用,并随浓度的增高而增加。结论:靛玉红(15μM～90μM)具有抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成的作用,其机制可能是通过阻断VEGF/VEGFR2信号通路的某个环节来发挥作用。     

大青叶中靛玉红的抗血管生成活性研究

 目的 研究大青叶中靛玉红的抗血管生成活性。方法 采用斑马鱼模型和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型对靛玉红抑制血管生成活性进行测定。结果 10,50 mg·L-1的靛玉红能显著抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成,抑制率为20.9%和38.4%。每个鸡蛋分别加入5, 7.5和10 μg 靛玉红处理72 h后,CAM血管生成被显著抑制,抑制率为32.70%,41.61%和51.43%。结论 靛玉红具有显著的抗血管生成活性。     

西黄丸及其拆方药味对斑马鱼胚胎血管生成的影响

目的研究西黄丸中具有抑制血管生成活性的组方药味.方法采用发育时间为24 h的血管荧光标记转基因斑马鱼胚胎作为模型,荧光显微镜下观察50μg/mL西黄丸甲醇提取物及其组方药味人工牛黄、人工麝香、乳香和没药甲醇提取物20 μg/mL给药24 h后对斑马鱼节间血管(Ⅳ)形成的影响.结果人工麝香、没药提取物对斑马鱼Ⅳ数量无影响,人工牛黄组Ⅳ数为22.67±2.60,抑制率为17.3%;乳香提取物组Ⅳ数分别为17.2±5.71,抑制率为37%;与对照组比较,人工牛黄、乳香提取物具有显著的抑制斑马鱼Ⅳ生成的作用(P<0.05或0.01).结论乳香与人工牛黄是西黄丸中具有抑制血管生成作用的主要药味.     

绿原酸对flila-EGFP转基因斑马鱼血管生成COX2-MMPs信号通路的调控作用

目的探讨绿原酸对flila-EGFP转基因斑马鱼血管生成COX2-MMPs信号通路的调控作用。方法将100个受精后22 h的flila-EGFP转基因斑马鱼胚胎随机分为空白组、阳性对照组及绿原酸高、中、低剂量组,每组20个。阳性对照组给予瓦他拉尼(PTK787)5 pg/mL干预,绿原酸高、中、低剂量组分别给予新鲜配置好的绿原酸200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL干预。干预26 h后各组胚胎在体视显微镜(明场)和体视荧光显微镜下进行血管表型观察和拍照,然后将各组斑马鱼胚胎匀浆处理,利用Real-time PCR方法检测各组斑马鱼胚胎中COX-2 mRNA、MMP-9mRNA、MMP-2 mRNA表达水平。结果与空白组比较,绿原酸各组斑马鱼血管抑制明显;绿原酸各组及PTK787组COX-2 mRNA、MMP-9mRNA、MMP-2 mRNA表达水平均明显低于空白组,且绿原酸高剂量组明显低于绿原酸中剂量组,绿原酸中剂量组明显低于绿原酸低剂量组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论绿原酸能够抑制转基因斑马鱼胚胎新生血管生成的机制与下调COX2-MMPs信号通路,从而抑制MMP-9和MMP-2基因表达有关。     

瓜蒌不同部位对斑马鱼促血管生成及心脏保护作用

目的采用斑马鱼模型探讨中药瓜蒌不同部位对心脏保护和促血管生成作用,为阐明瓜蒌的药效物质基础及作用机制提供研究基础。方法瓜蒌药材粉碎后用70%乙醇提取、浓缩,然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。以TG(VEGFR2∶GFP)系荧光转基因斑马鱼为模型动物,将瓜蒌总样和不同萃取部位设置不同质量浓度,观察他们对斑马鱼体节间血管(intersegmental vessels,ISV)数和心率的影响。结果 10μg/mL正丁醇萃取物和1μg/mL水层样品具有促进斑马鱼体间血管数生成活性;石油醚萃取物和总样对特非那定引起的心脏毒性具有明显的改善作用。结论瓜蒌能促进斑马鱼的血管生成并具有心脏保护作用。     

斑马鱼血栓模型在中药抗血栓活性筛选中的适用性研究

目的考察斑马鱼血栓模型在中药抗血栓活性筛选中的适用性。方法采用盐酸肾上腺素诱导建立活体斑马鱼血栓模型。将斑马鱼随机分为空白组、模型组、阳性对照组、给药组,各组给予相应药物或胚胎培养水。16 h后,用邻联茴香胺染色液染色,计算斑马鱼心脏红细胞染色强度,进行定量分析;观察转基因斑马鱼血小板聚集情况,进行定性分析。结果与模型组比较,100μg/mL丹酚酸B,300、900μg/mL丹参水提取物,45μg/mL 95%乙醇提取物,400、1200μg/mL消栓通络片均能明显抑制斑马鱼的血栓形成(P0.01)。结论斑马鱼血栓模型对中药抗血栓活性筛选具有良好的适用性。     

清热活血方对斑马鱼胚胎血管新生的影响及安全性

目的观察清热活血方对斑马鱼胚胎血管新生的抑制作用并探讨其安全性。方法选取受精后2天的斑马鱼胚胎120个,置于12孔板中,每孔10个。分为空白组、阳性药组和清热活血方50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml组,阳性药组给予浓度为50μg/ml瓦他拉尼(PTK787) 3ml,清热活血方各浓度组给予相应浓度清热活血方3ml,各组连续给药72h,每24h更换暴露液,在体式显微镜下观察统计斑马鱼胚胎体节间血管指数及镜下荧光点数。通过预实验确定清热活血方最大非致死浓度(MNLD)为802μg/ml和最小全致死浓度(MTLD)为2560μg/ml,在此区间设定8个药物浓度,建立致死曲线,计算半数致死浓度(LD50)。选用1/10 MNLD(80μg/ml)、1/3 MNLD(267μg/ml)、MNLD 3个浓度作为毒性指标观察的给药浓度,给予药物暴露液3ml,连续给药72h,显微镜下计数斑马鱼胚胎心率,并记录各浓度清热活血方对各个脏器系统及其他表型指标产生的影响,包括斑马鱼胚胎卵黄、肠腔、肠褶皱、尾鳍等。结果与空白组比较,阳性药组及清热活血方100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml组斑马鱼胚胎体节间血管指数及镜下荧光点数均降低(P0.01)。清热活血方100μg/ml组、150μg/ml组、200μg/ml组之间比较,随着中药浓度的增加斑马鱼胚胎体节间血管指数显著降低(P0.05),而各组斑马鱼胚胎镜下荧光点数仅有减少趋势而差异无统计学意义(P0.05)。根据清热活血方致死曲线可得LD50为1200μg/ml,安全指数为5.1。与空白浓度比较,清热活血方267μg/ml、802μg/ml浓度干预时斑马鱼胚胎心率显著增快(P0.01),80μg/ml浓度对斑马鱼胚胎心率影响不明显(P0.05),267μg/ml浓度与802μg/ml浓度对斑马鱼胚胎心率增快的程度差异无统计学意义(P0.05)。当浓度高于267μg/ml时,清热活血方对斑马鱼胚胎的发育表现出实质性的毒性作用,如肠褶皱消失、肠变性等。结论浓度为100μg/ml的清热活血方对斑马鱼胚胎有较强的抑制血管新生的作用,且具有安全性。     

RP-HPLC法同时测定宝咳宁颗粒中4种成分

目的采用RP-HPLC-二极管阵列检测器同时测定宝咳宁颗粒(黄芩、前胡、枳壳、青黛、麻黄、桑叶)中的柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素。方法采用汉邦Dubhe-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,柚皮苷、黄芩苷和靛玉红的检测波长为280 nm,百花前胡甲素检测波长为321 nm。结果柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素在5～120μg/mL、2～60μg/mL、0.5～5.0μg/mL、0.01～0.10μg/mL范围内线性关系良好(r﹥0.999 0),加样回收率良好,在97.4%～103.9%之间。结论采用乙腈-0.05%磷酸为流动相能改善色谱峰峰型和基线漂移,本方法可用于宝咳宁颗粒的产品的质量控制。     

靛玉红对肿瘤血管内皮细胞增殖迁移及血管形成的影响

目的探讨靛玉红(Indirubin)对肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移、血管形成影响。方法采用肝癌Hep G2细胞上清诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)成为肿瘤血管内皮细胞(tumor-derived endothelial cells,TdEC),通过MTT法、细胞迁徙试验、血管形成实验检测靛玉红对HUVEC与Td-EC增殖、迁移、血管形成的影响。结果靛玉红在体外对Td-EC有显著的生长抑制作用,并具有时间和浓度依赖性;一定浓度的靛玉红能显著降低Td-EC细胞迁徙活性和抑制血管的形成,而同样条件下,靛玉红对HUVEC的抑制作用弱于Td-EC。结论靛玉红在体外可特异地抑制Td-EC增殖、迁移、血管形成。     

HPLC测定防感气雾剂中靛玉红和绿原酸含量

目的：建立防感气雾剂中靛玉红和绿原酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法,ODS-C18,靛玉红以甲醇-0.1%醋酸溶液（72∶28）为流动相,检测波长290 nm;绿原酸以甲醇-0.4%磷酸溶液（15∶85）为流动相,检测波长327 nm。结果：靛玉红在0.15～4.8μg/mL范围内峰面积与浓度呈良好线性关系,回收率=100.31%,RSD=2.26%;绿原酸在0.24～15μg/mL范围内呈良好线性关系,回收率=98.13%,RSD=2.23%。结论：该法简便、准确,可用于测定防感气雾剂中靛玉红和绿原酸的含量测定。     

模式生物斑马鱼在中药药效物质筛选中的应用进展

与哺乳动物相比,斑马鱼在药物药效筛选方面具有独特的优势,目前已受到医药学界越来越多的重视。近年来,对斑马鱼的探索已延伸和扩展到中药领域,特别是对我国具有多靶点、多途径、多环节作用的传统单味中药、复方和中成药等药效物质的筛选。作为一种完整的动物模型,斑马鱼可以对中药中发挥作用的有效化学成分进行全方面、深层次的研究,进而实现对中药药效物质进行便捷、快速和高通量的筛选。结合国内外近5年文献报道,综述了模式生物斑马鱼在中药药效物质筛选方面的最新研究进展,主要从筛选心血管药物、调脂保肝药物、抗骨质疏松药物、抗肿瘤药物、抗炎药物和其他药物6个方面和独特优势进行归纳总结,以期为模式生物斑马鱼在中药中的应用研究提供新的思路,以及为研究人员在中药新药研究方面提供借鉴参考。     

基于斑马鱼模型的药物毒性研究进展与中药毒性研究新策略

斑马鱼是近年来用于药学领域研究的热门模式生物,其优势在于化合物的高通量活性筛选及毒性评价。斑马鱼毒性评价模型集成在体动物与体外细胞模型的优势,具有高效、低成本的特点,在国外已成为化合物早期安全性快速甄别的有效模型,国内将斑马鱼模型用于中药毒性研究正日益兴起。综述了斑马鱼在药物毒性研究方面的进展,提出斑马鱼模型在中药毒性研究中的新策略。     

斑马鱼作为一种重要的工具进行肝脏疾病研究

随着肝胆相关疾病发病率的增加,深入理解肝病发展过程中分子、细胞和生理因素在中医药临床诊断和治疗中的作用显得尤为重要。合适的动物模型能够帮助针对性的识别相关疾病的可能机制。斑马鱼Danio rerio模型传统上主要用于研究胚胎发育,近些年已经被逐渐的用于肝脏疾病、相关药物筛选和评价等方面的研究。斑马鱼胚胎发育迅速,5日龄幼鱼的消化器官全部成熟。在此阶段内,它们可发展为由发育缺陷或化合物诱导的肝胆疾病。斑马鱼肝脏在细胞组成、功能、信号传导、对损伤的反应以及介导肝脏疾病的细胞过程等方面与人类相似。不仅如此,人类和斑马鱼之间基因、蛋白的高度保守性,使其成为研究肝脏疾病基本机制的一个可替代系统。因此,可以通过基因筛查以鉴定涉及特定疾病过程的新基因,通过化学筛查作用于特定过程的药物。该文介绍了斑马鱼作为模式系统的实验属性,并强调斑马鱼模型在肝脏疾病等方面的,尤其是脂肪肝方面,相关病理机制以及药物筛选、评价的研究进展,以期为未来中医药肝毒性评价提供思路和技术。     

健脾疏肝降脂方对过度喂养导致的肥胖斑马鱼脂质代谢的影响

目的研究斑马鱼作为治疗肥胖药物筛选模型的可行性以及健脾疏肝降脂方对肥胖斑马鱼脂质代谢的影响。方法将受精14 d的斑马鱼分为对照组、模型组(0 mg/L)、高剂量组(1 600 mg/L)、中剂量组(400 mg/L)和低剂量组(100 mg/L),对照组正常喂养,其余4组过度喂养。过度喂养后的斑马鱼在相应浓度的药液中浸泡,每天浸泡8 h。药物干预56 d后测量斑马鱼的体长、体质量,计算肥满度,检测斑马鱼总胆固醇和三酰甘油水平、肝脏的组织学变化以及脂肪堆积情况。结果模型组斑马鱼质量、肥满度和三酰甘油水平均比对照组高(P0.05);与模型组比较,高剂量组斑马鱼质量、肥满度和三酰甘油水平均降低,差异有统计学意义(P0.05);中剂量组斑马鱼三酰甘油水平降低,差异有统计学意义(P0.05)。模型组肝脏组织学变化、脂肪堆积明显,健脾疏肝降脂方组斑马鱼肝脏组织学变化、脂肪堆积少于模型组。结论斑马鱼可成功用于建立肥胖模型;健脾疏肝降脂方可有效降低斑马鱼体脂水平,降脂效果明显。     

模式生物斑马鱼模型在方药研究中的应用＊

斑马鱼在毒理研究、活性成分筛选、药效评价和代谢研究等方面发挥着重要作用。斑马鱼作为活体动物模型，具有筛选周期短，易于观察，与人类相关性高等优点，对于成分复杂的方药样品有很好的适应性，逐渐应用于中医药研究当中。探讨了模式生物斑马鱼模型在方药效应评价、配伍规律研究中的应用及机制研究进展，以期有利于方药基础研究的发展。     

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??OBJECTIVE To investigate active constituents of Psoralea corylifolia L. against osteoporosis using chromatography capture combined with zebrafish model. METHODS High performance liquid chromatography (HPLC) was used for analysis and capture components of Psoralea corylifolia L. including coumarins, flavonoids and bakuchiol, and which anti-osteoporosis activity was evaluated by zebrafish model induced by 25 ??mol??L^-1 prednisolone, 25 ??mol??L^-1 prednisolone as model group, and 0.4% DMSO medium as vehicle group. Bone of juvenile zebrafish cultured to 8 dpf (day post fertilization) were stained with alizarin red, and inspected with optical microscope, and bone staining area was quantitative analyzed using image software. RESULTS The RESULTS showed that coumarins and flavonoids can significantly resist bone loss of zebrafish by prednisolone, while the action of bakuchiol was relative weak with heavy toxicity, high dose of bakuchiol led to zebrafish larval death. CONCLUSION HPLC can system analysis and capture ingredients/components of Psoralea corylifolia L., and zebrafish osteoporosis model can evaluate activity of micro ingredients/components, combination of these two METHODS can broke through double bottleneck of complex components capture and activity evaluation in vivo. It is expected to realize efficient anti-osteoporosis screening of the whole component of Chinese herbal medicine.     

醋甘遂不同提取物对斑马鱼幼鱼的毒性

目的:研究非致死剂量醋甘遂对斑马鱼幼鱼的毒性及毒性可逆性,并验证斑马鱼模型用于中药毒性快速评价的可行性。方法:用索氏提取器以不同极性溶剂依次提取样品,制备不同提取物。将健康斑马鱼成鱼配对产卵,以正常发育受精后3 d的斑马鱼幼鱼为模型,用醋甘遂不同极性提取物处理斑马鱼幼鱼,统计给药72 h死亡率,对毒性最强的提取部位观察评价其对斑马鱼心血管系统、肝脏、神经系统、胃肠道系统、肾脏及其他脏器系统的毒性特征及可逆性。结果:醋甘遂不同溶剂提取物毒性顺序依次为石油醚提取物二氯甲烷提取物乙酸乙酯提取物乙醇提取物,与空白组比较,石油醚提取部位处理后的幼鱼给药组肝区相对光强度随给药浓度的升高而降低,肝脏颜色变暗(P0.01);肝脏经苏木精-伊红染色后,在石油醚提取部位0.054 mg·L~(-1)给药组中有轻微的肝损伤,在恢复组中肝损伤明显好转。与空白组和石油醚提取部位0.004 mg·L~(-1)组比较,肠道尼罗红排泄实验显示残留率在石油醚提取部位0.012,0.036,0.054 mg·L~(-1)组中显著下降(P0.01),胃肠道被促进排空。其他系统毒性特征不明显,差异均无统计学意义。结论:醋甘遂的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇提取物中,石油醚提取物毒性最大,且主要毒性为肝毒性和胃肠道刺激性,肝毒性造成肝变性,具有可逆性。斑马鱼模型快速评价中药毒性具有较好的应用前景。     

斑马鱼模型在中医药研究中的应用

目前,斑马鱼模型的使用正逐渐拓展到生命体多个系统的发育、功能和疾病的研究中,其在中医药领域的研究也越来越多：主要集中在中药毒理研究、代谢研究和重大疾病中药成分活性筛选等方面的研究,本文将就斑马鱼在筛选模型、现代生物技术与传统中医中药研究相结合的新型模式等应用情况进行探讨,以期有益于中医药事业的现代研究的迅速发展。     

血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达,为构建药物筛选的在体模型提供依据。方法采用多聚酶链式反应,扩增了长约280bp的斑马鱼血管发生素-1 cDNA部分序列,作为探针,以原位杂交法测定了血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其相应受体flk-1和Tie-2的表达。结果从受精卵胚胎发育第12小时可见血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其相应受体flk-1和Tie-2的表达;在受精卵胚胎发育的第16小时,血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1主要在头部和尾部胚芽表达;第24小时在眼球、视窝、中脑、后脑的腹前侧和肌节中表达,Tie2和F lk-1主要在肌间背部动脉血管、躯干新生血管芽和轴向静脉中表达。结论血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼胚胎发育早期的血管发生过程中可能相互作用,并协调血管发生过程。斑马鱼是研究胚胎发育早期微血管发生和血管发生的极佳动物模型,可用于促血管发生或抑制血管发生药物筛选。     

基于斑马鱼M-Act/Tox一体化评价的抗骨质疏松中药高效筛选思路与方法

日益显现的壮骨中药肝损伤问题为临床应用带来挑战,抗骨质疏松中药筛选有必要兼顾有效性与安全性,而代谢转化至关效应与毒性,故全面考虑代谢-效/毒一体的筛选具有意义。评价模型和化合物(含代谢物)数量严重制约早期在体、高效筛选。参考课题组前期相关研究及国内外文献,提出斑马鱼代谢模型、骨质疏松模型及毒性评价法有机整合可建立M-Act/Tox(metabolism-action/toxicity)一体化的抗骨质疏松中药高效筛选法。突破量微成分无法在体、高效及一体化评价的难点和盲点,实现基于体内过程且兼顾有效性与安全性的全方位抗骨质疏松中药高效筛选,对加速发现安全有效的抗骨质疏松创新中药具有意义。