雷帕霉素抑制口腔鳞癌细胞增殖及其分子机制研究

目的 通过不同浓度雷帕霉素干预口腔鳞癌细胞系SCC-4的增殖情况，检测雷帕霉素干预后p-AKT、p-STAT3、p-S6K1及免疫因子在SCC-4中的表达，探讨雷帕霉素对口腔鳞癌细胞体外生长的抑制作用及其分子机制。方法 采用20、40、80μmol/L雷帕霉素分别干预体外培养的SCC-4，并设含0μmol/L雷帕霉素的培养液作为对照组，作用24h后，通过MTT检测不同浓度雷帕霉素对于SCC-4增殖的影响；使用Western blotting方法检测雷帕霉素对PI3K/AKT/mTOR信号通路相关相关蛋白（AKT,STAT3,S6K1）磷酸化情况变化；通过酶联免疫吸附法检测雷帕霉素对PI3K/AKT/mTOR信号通路下游共刺激因子B7-H1表达的影响。结果 MTT结果显示雷帕霉素对于SCC-4细胞的抑制效应呈明显的浓度依赖关系；酶联免疫吸附法结果表明雷帕霉素能够降低PI3K/AKT/mTOR信号通路下游相关共刺激分子（B7-H1）的浓度；蛋白免疫印迹结果则表明在雷帕霉素干预下SCC-4细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-AKT,p-STAT3,p-S6K1表达水平明显降低...     

血竭素高氯酸盐对舌鳞癌细胞Tca-8113增殖及凋亡的影响

目的:研究血竭素高氯酸盐(Dracorhodin perchlorate,DP)对舌鳞癌细胞Tca-8113增殖和凋亡的影响并初步探讨其相关机制。方法:以舌鳞癌细胞Tca-8113为研究对象,采用CCK-8、流式细胞术分析及Western Blot等方法检测不同浓度DP对Tca-8113细胞的增殖、凋亡及核因子E2-相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶 1(heme oxygenase 1,HO-1)蛋白表达的变化。采用SPSS17.0统计软件对实验结果进行分析。结果:CCK-8检测表明,与空白对照组相比,DP可以显著抑制细胞增殖,且对细胞的增殖抑制作用有时间-剂量依赖性(P<0.05)。流式细胞术及Western Blot检测结果显示DP可以促进细胞凋亡(P<0.05),并提高Nrf2、HO-1在Tca-8113细胞中的表达。结论:DP能抑制舌鳞癌细胞Tca-8113增殖并诱导其发生凋亡,其作用可能与Nrf2/HO-1信号通路激活有关;可能成为抗口腔癌药物。     

IGF2BP1在口腔鳞癌细胞耐药中的作用及机制探讨

目的: 探讨IGF2BP1在口腔鳞癌细胞顺铂耐药中的作用和机制。方法: 运用小剂量间歇诱导法诱导顺铂敏感的口腔鳞癌细胞HN30,建立顺铂耐药口腔鳞癌细胞系HN30/DDP。通过蛋白免疫印迹方法检测亲本株与耐药株的IGF2BP1表达差异;利用siRNA和慢病毒过表达载体分析IGF2BP1基因表达水平降低或升高对癌细胞顺铂耐药的影响;应用MTT法检测IGF2BP1基因降低或升高后口腔鳞癌细胞对顺铂的IC₅₀。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 成功建立顺铂耐药的口腔鳞癌细胞系HN30/DDP,耐药细胞株较亲本株的耐药性明显提高。敲低HN30/DDP中的 IGF2BP1 表达水平,细胞耐药性降低;反之,亲本株细胞过表达 IGF2BP1后,细胞耐药性提高。Akt 信号通路活化是介导 IGF2BP1 促进口腔鳞癌细胞顺铂耐药的关键因素。结论: IGF2BP1 与口腔鳞癌的顺铂耐药密切相关。IGF2BP1 可通过激活下游 Akt 信号通路,促进口腔鳞癌细胞耐药。     

三氧化二砷结合低剂量照射对口腔癌细胞抑制作用的研究

目的探讨三氧化二砷（AS2O3）和低剂量照射（750cGY）结合对口腔鳞癌细胞和人血管内皮细胞的体外抑制作用。方法采用MTT法检测不同浓度AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对口腔鳞癌细胞系Tca8113细胞和KB细胞以及人血管内皮细胞系（HUVEC）增殖的影响;通过克隆形成试验、流式细胞技术检测不同浓度AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对Tca8113和KB细胞的克隆形成抑制和诱导凋亡作用;采用体外血管形成试验验证AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）血管形成的作用。结果 AS2O3结合低剂量照射对Tca8113细胞、KB细胞和人血管内皮细胞都有明显的生长抑制作用,还可以诱导Tca8113细胞和KB细胞凋亡并显著抑制两种细胞的体外克隆形成率。AS2O3和低剂量照射结合使人血管内皮细胞体外血管的形成明显减少。结论 AS2O3结合低剂量照射对口腔鳞癌细胞具有显著的体外生长抑制及凋亡诱导作用,还可以明显抑制体外血管形成。     

扁塑藤素对口腔鳞癌细胞侵袭和迁移的影响

目的:探讨扁塑藤素对人口腔鳞癌细胞侵袭和迁移能力的影响及其可能的作用机制.方法:体外培养人口腔鳞癌细胞系CAL-27和SCC-15,不同浓度扁塑藤素诱导两种细胞后,CCK-8实验检测扁塑藤素对两种细胞增殖能力的影响,计算扁塑藤素不同作用时间的半数抑制浓度IC50;划痕实验及Transwell小室实验分别检测扁塑藤素对口...     

全反式维甲酸和三氧化二砷对人口腔鳞癌细胞系KB细胞周期的影响

目的研究全反式维甲酸（all-trans retinoi cacid,ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导分化对人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞周期的影响及意义。方法采用流式细胞技术观察人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞经不同浓度ATRA和As2O3诱导分化后96h时的细胞周期的变化。结果ATRA作用于KB细胞后,加药组与对照组相比,被阻断在G1期的细胞比率轻度升高,S期比率下降,抑制率随浓度增高无明显升高的趋势。As2O3三个不同浓度作用KB细胞96h时,没有明显改变各细胞周期所占的比例。抑制率随作用浓度的增加而升高。结论ATRA和低浓度As2O3对人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞具有诱导分化作用,ATRA诱导KB细胞分化可能与G1、G0期阻滞有关。     

姜黄素对口腔鳞癌SCC-25细胞EGFR信号通路表达的影响

目的:探讨姜黄素对口腔鳞癌SCC-25细胞EGFR信号通路表达的影响及其相关的分子机制。方法:不同浓度姜黄素作用细胞24 h,MTT法检测姜黄素对细胞增殖作用的影响,Transwell实验检测EGF和姜黄素共同作用下细胞侵袭能力的变化,Western blot检测姜黄素对SCC-25细胞EGFR活性及下游信号分子(Akt、ERK1/2和STAT3)表达的影响。结果:不同浓度姜黄素作用SCC-25细胞24 h后,均可抑制SCC-25细胞增殖,亦可以抑制EGF诱导的细胞侵袭转移。Western blot结果显示姜黄素对SCC-25细胞总EGFR表达无影响,但可以剂量依赖性抑制SCC-25细胞p-EGFR表达,同时可以剂量依赖性抑制EGFR信号通路下游转录因子Akt、ERK1/2和STAT3磷酸化。结论 :姜黄素可剂量依赖性抑制SCC-25细胞EGFR磷酸化活性及其下游信号通路分子(Akt、ERK1/2、STAT3)的磷酸化。     

Naa10基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对口腔鳞癌细胞生长的影响

目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10, Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10 均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功, pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×10⁹ TU/mL和1.0×10⁹ TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10 shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。     

蛋白激酶D1在调节口腔鳞癌细胞增殖、凋亡及药物敏感性中的作用

目的 探讨蛋白激酶D1（PKD1）在人口腔鳞癌细胞SCC-25生长、凋亡及化疗药物敏感性中的作用和机制。方法 转染control-shRNA和PKD1-shRNA质粒,建立PKD1基因沉默的SCC-25细胞系;CCK-8及流式细胞术检测PKD1基因沉默后细胞的增殖、凋亡及细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及多药耐药蛋白P-gp的表达变化。结果 PKD1在口腔肿瘤细胞SCC-25、CAL-27、SACC-83中呈现高表达;PKD1基因沉默后SCC-25细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低,细胞生长受到抑制,凋亡增加;多药耐药蛋白P-gp表达下调,紫杉醇半数抑制浓度及耐药指数明显降低。结论 PKD1通过调控SCC-25细胞内凋亡相关蛋白表达和多药耐药蛋白P-gp表达,调控SCC-25生长、凋亡和对药物敏感性,是口腔鳞癌细胞生物治疗潜在靶点。     

薯蓣皂苷对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨薯蓣皂苷对人口腔鳞癌细胞SCC-4和SCC-25增殖和凋亡的影响。方法:不同浓度(0、0.1、0.3、1、3、10、30μmol/L)薯蓣皂苷处理SCC-4和SCC-25细胞24、48、72 h后,CCK-8法检测薯蓣皂苷对SCC-4和SCC-25细胞存活的影响,根据IC₅₀值筛选出后续实验浓度(0、1、2、4μmol/L);EdU检测薯蓣皂苷对SCC-4和SCC-25细胞增殖的影响;流式细胞术检测薯蓣皂苷对SCC-4和SCC-25细胞凋亡的影响;Western Blot检测薯蓣皂苷处理48 h后,细胞中Noxa、Cleaved-Caspase 3蛋白的表达水平;qRT-PCR检测细胞中Noxa mRNA表达情况。结果:在一定浓度范围内,薯蓣皂苷可抑制口腔鳞癌细胞SCC-4和SCC-25的增殖,呈时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05)。同时,实验组(1、2、4μmol/L)薯蓣皂苷干预48 h后可促进SCC-4和SCC-25细胞的凋亡(P<0.05),并上调细胞中Noxa、Cleaved-Caspase 3的表达水平,且SCC-4和SCC-2...     

低氧诱导下舌鳞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF的表达及TSA对其表达的抑制

目的:观察低氧与人舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF表达的相关性,曲古抑菌素A(TSA)对其表达的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:体外培养的舌鳞状细胞癌SCC-6细胞,经不同作用时间去铁胺处理,模拟低氧条件培养后,RT-PCR检测HIF-1α、VEGF的mRNA表达,Western Blot检测其蛋白表达;模拟低氧条件下,不同浓度、时间梯度TSA处理SCC-6细胞后,分别检测HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白表达。结果:①低氧下SCC-6细胞HIF-1α蛋白表达增加,但其mRNA的表达不受影响;作为HIF-1α下游基因的VEGF的mRNA和蛋白表达,随HIF-1α蛋白表达增加而增加;②低氧下,TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达及VEGF的mRNA和蛋白表达,并呈量效和时效关系,但HIF-1α的mRNA表达不受影响;③HIF-1α的调节在蛋白水平。结论:体外条件下,模拟低氧可诱导舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α蛋白、其下游基因VEGF的mRNA和蛋白的表达增加。TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达,进而抑制其下游基因VEGF的表达,从而发挥抗肿瘤血管生成的作用,并且呈量效和时效关系。     

MTUS1／ATIP1对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨过表达MTUS1/ATIP1对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响。方法检测人舌鳞癌系UM1、SCC鄄9、SCC鄄15、Tca8113细胞株中MTUS1的表达水平。应用含ATIP1片段的质粒转染舌鳞癌细胞,48 h后MTT检测舌鳞癌细胞的增殖能力;应用流式细胞仪技术和细胞免疫荧光技术检测细胞周期和细胞凋亡率;Western blot检测舌鳞癌细胞中MTUS1、p53、ERK1/2的表达情况。结果转染MTUS1/ATIP1后细胞的增殖明显受到抑制,其抑制率约为40％（t=0.023,P＜0.05）;高表达MTUS1/ATIP1可导致舌鳞癌细胞株G1期阻滞（G1期：t=0.032,G2期：t=0.036,S期：t=0.027,P＜0.05）并诱导细胞凋亡率的明显升高,差异具有统计学意义（t=0.005,P＜0.05）。 Western blot检测显示,转染MTUS1/ATIP1后ERK的表达升高,磷酸化的ERK表达下降,p53的表达升高。结论 MTUS1可抑制舌鳞癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡。     

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提要：发展一种新的方法用来提高口腔癌的诊断和治疗效果,建立能够模拟人类口腔鳞癌自然发生的动物模型是必需的,应用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline-1-oxide, 4NQO）诱导SD大鼠舌黏膜鳞癌是一种可靠的方法。水溶性喹啉衍生物4NQO可以形成DNA加成物,引起碱基的改变（G→A）或丢失突变。但4NQO要发挥这种诱变剂作用,需要在4NQO还原酶作用下将4NQO转化成4-羟氨基喹啉-1-氧化物及4-乙酰基喹啉-1-氧化物（4-AAQO）,4-AAQO能够以共价键的方式结合到核酸上并破坏染色体的结构,进一步影响抑癌基因和癌基因表达。动物舌根黏膜该酶含量较高,所以可以靶向性在舌根形成癌。饮水中很低剂量的4NQO便可特异性在舌根形成癌,其形成过程和形态学变化都和人的口腔鳞癌发生过程十分相似,该模型是研究口腔癌发生和癌变机制的理想模型。     

NKG2D在口腔鳞癌患者CD3(+)CD56(+)NKT细胞中的作用

目的:探讨口腔鳞癌患者CD3(+)CD56(+)NKT细胞NKG2D受体抗肿瘤免疫的调节作用.方法:分别从30例口腔鳞癌患者和30例正常人外周血中提取CD3(+)CD56(+)NKT细胞,实时定量PCR和Western印迹分析NKG2D在分子水平和蛋白水平的表达差异.通过siRNA-NKG2D转染方法,分析NKG2D受体对CD3(+)CD56(+)NKT细胞的细胞毒性,分泌IL-2和IFN-μ的影响.采用SPSS13.0软件包对数据进行t检验和方差分析.结果:口腔鳞癌患者CD3(+)CD56(+)NKT细胞NKG2D的表达显著低于正常人(P＜0.05);转染siRNA-NKG2D的CD3(+)CD56(+)NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用显著降低.结论:与正常人相比,口腔鳞癌患者中CD3(+)CD56(+)NKT细胞因NKG2D表达下降,其肿瘤免疫调控作用受到影响.这些发现为NKG2D应用于口腔鳞癌的免疫治疗奠定了基础.     

微小RNA-21反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用

目的探讨微小RNA-21（miR-21）反义寡核苷酸（miR-21ASO）对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用。方法通过转染miR-21ASO，采用实时荧光定量RT—PCR（qRT—PCR）检测舌鳞癌细胞株SCC-15和CAL27中miR．21的表达变化，荧光素酶活性检测实验分析miR-21ASO在舌鳞癌细胞中的调控功能．并运用多种细胞增殖和凋亡检测方法以观察miR-21ASO对舌鳞癌细胞调控产生的系列效应。结果miR-21在两株舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27中的表达显著高于在正常舌鳞状上皮细胞中的表达（P=0．037，0．015），转染miR-21ASO可显著抑制其表达（P=0．017，0．006），miR-21对荧光素酶活性的抑制率由50％显著减少到20％以下（P=0．002，0．003），SCC-15和CAL27细胞存活率比转染前明显降低（P=0．002，0．004），细胞克隆形成率比转染前明显降低（P=0．007，0．032）；流式细胞仪检测显示转染miR-21ASO后．SCC-15和CAL27细胞凋亡明显增加，激光共聚焦显微镜观察到线粒体细胞色素C释放较转染前增加。结论miR-21ASO对舌鳞癌细胞miR-21水平降低具有靶向特异性．转染miR-21ASO可有效抑制miR-21的促癌效应，利用反义核酸技术的高度特异性开展针对促癌microRNA分子的靶向治疗将可能为舌鳞癌的基因治疗开辟新的途径。     

LPS刺激对体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶表达的影响

目的检测脂多糖（LPS）刺激后体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶-1和环氧合酶-2（COX-1,COX-2）表达的改变,探讨牙龈成纤维细胞与牙周炎症发生发展的关系。方法组织块法原代培养正常人牙龈成纤维细胞并进行来源鉴定,MTT法检测不同浓度LPS刺激后活细胞数量的改变;以10ug/ml刺激第4代细胞,24h后用免疫细胞化学方法检测COX-1和COX-2在细胞中的表达,多功能彩色细胞分析管理系统进行图像分析和统计学分析。结果 LPS刺激可使牙龈成纤维细胞的增殖速度降低,生长曲线大致呈＂S＂形;10ug/ml LPS刺激24h后细胞数量未见明显变化。免疫细胞化学染色结果显示COX-1在LPS刺激前后均有表达但无显著差异（P〉0.05）,COX-2在LPS刺激前无表达,LPS刺激后则表达增强并有显著差异（P〈0.01）。结论 LPS对牙龈成纤维细胞生长增殖有抑制作用,不影响COX-1的表达强度,但可使COX-2表达显著增强,说明牙龈成纤维细胞对LPS刺激的反应可能影响牙周炎症进展。     

细胞角蛋白13在全反式维甲酸和三氧化二砷诱导分化人口腔鳞癌细胞系KB中的表达

目的研究细胞角蛋白（cytokertin,CK）13及其基因在全反式维甲酸（all—transretinoicacid,ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导分化人口腔未分化鳞癌细胞系KB中的表达和意义。方法采用MTT法观察ATRA和As2O3对KB细胞的敏感程度,Western blot法和RT—PCR法观察KB细胞经ATRA和As2O3诱导分化后的CK13和CK13-mRNA的表达。结果MTT法显示ATRA和As2O3的ICS0分别为35．9×10^-6mol／L和1．55×10^-6mol／L,As2O3对KB细胞药物化学敏感性比ATRA高;Western blot法显示ATRA和As2O3对KB细胞诱导分化后24hCK13无表达,48hCK13出现弱表达,72hCK13出现明显的表达;RT-PCR法显示ATRA和As2O3对KB细胞诱导分化后24hCK13-mRNA表达明显升高,48h达到高峰,72h出现下降的趋势,并且CK13-mRNA的表达变化提前于CK13的表达。结论CK13可作为口腔鳞癌诱导分化标记物和判断临床口腔鳞癌诱导分化疗效的指标。