RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

RNA干扰抑制基质细胞衍生因子-1基因的表达

目的通过RNA干扰来抑制骨髓基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达。方法利用脂质体介导人SDF-1特异性小片段双链RNA(siRNA)的表达质粒转染培养的人骨髓基质细胞,G418筛选阳性克隆。RT-PCR和ELISA法检测培养细胞SDF-1 mRNA和上清液SDF-1蛋白。以转染随机变更siRNA碱基序列的表达质粒和未转染的来源相同的骨髓基质细胞作为对照。结果较未转染和转染随机变更siRNA碱基序列表达质粒的骨髓基质细胞,转染SDF-1特异性siRNA表达质粒的骨髓基质细胞SDF-1 mRNA和SDF-1蛋白明显降低。结论用SDF-1特异性siRNA的表达质粒转染骨髓基质细胞,抑制了SDF-1基因表达。     

下调TSPO表达不影响脂多糖诱导的小胶质细胞TNF-α和IL-1β以及IL-6的分泌

目的研究相对分子质量(Mr)18 000转运蛋白(TSPO)基因表达下调对脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞分泌TNF-α,IL-1β和IL-6的影响。方法以RNA干扰技术建立TSPO基因表达下调的细胞模型,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测转染TSPO siRNA BV-2细胞TSPO mRNA及蛋白水平表达的效果;用qRT-PCR法检测TSPO基因下调后小胶质细胞BV-2在LPS作用下分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平表达的情况;ELISA检测TSPO基因下调小胶质细胞BV-2在LPS作用下分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平表达的变化。结果成功建立了TSPO基因下调的细胞模型,稳定表达TSPO siRNA细胞的TSPO mRNA和蛋白水平表达均明显下降,TSPO基因下调后BV-2细胞在LPS作用下分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的量无变化。结论下调TSPO的表达对LPS刺激引起的小胶质细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌无明显影响。     

livinβ-siRNA表达载体的构建及其在人星形胶质瘤细胞中的稳定表达

目的构建livinβ-siRNA表达载体,并观察其在人星形胶质瘤细胞(U251)中对livinβ基因表达的抑制。方法根据livinβ序列设计2条livinβ-siRNA特异性序列,PCR扩增方法合成2条siRNA链,与质粒pGenesil-11重组构建livinβ-siRNA表达载体,脂质体法转染人星形胶质瘤细胞(U251),RT-PCR和Western blot检测细胞中livinβ基因及蛋白表达。结果对重组质粒的双酶切鉴定和测序结果证明,livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA构建成功;RT-PCR检测转染组细胞中livinβmRNA表达水平明显低于对照组及空载体组,Western blot检测转染组细胞中livin蛋白表达水平明显低于对照组及空载体组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功构建了livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA,并且该载体能在真核细胞人星形胶质瘤细胞(U251)中稳定表达,并能抑制livinβ基因表达。     

IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。     

RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用.方法:利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度.结果:NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05).RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05).结论:体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应.     

BCSG1-siRNA在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌移植瘤组织中乳腺癌特异性基因BCSG1表达的抑制作用.方法 根据BCSG1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA,分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染人乳腺癌细胞系MCF7细胞中,以无关序列转染和未转染的MCF7细胞为对照.将用上述4条特异性siRNA和无关序列转染后的细胞连同未转染的MCF7细胞(共6组细胞)注入裸鼠皮下,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分析肿瘤生长抑制情况.采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学SP法分别检测6组裸鼠移植瘤中BCSG1 mRNA和BCSG1蛋白的表达情况.3组人肿瘤组织(浸润性导管癌、癌旁乳腺导管增生组织和乳腺纤维腺瘤)同时用作对照.结果 BCSG1-siRNA转染的4组的抑瘤率均明显大于无关序列转染组及未转染对照组(P＜0.01);与无关序列转染组及未转染对照组相比,BCSG1-siRNA转染的4组肿瘤组织中BCSG1蛋白的表达明显减弱;未转染细胞对照组和无关序列转染组、人乳腺浸润性导管癌组均有大量BCSG1 mRNA阳性条带,而在BCSG1-siRNA转染的4组中,仅有少量BCSG1较弱的mRNA阳性条带,与未转染细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 BCSG1-siRNA能有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠乳腺癌组织中BCSG1蛋白及mRNA的表达.     

IL-12p35 siRNA干涉对大鼠髓源性DC免疫功能的影响

目的:研究IL-12p35 siRNA干涉对大鼠髓源性树突状细胞(DC)免疫功能的影响.方法:通过粒细胞-巨噬细胞型集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和脂多糖(LPS)体外培养体系,从大鼠骨髓中获得DC,化学合成小型干扰RNA(siRNA),体外转染DC.DC细胞表面分子CD80和MHCⅡ表达采用流式细胞仪分析,检测IL-12p35转录采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,检测IL-12、IL-10分泌采用ELISA法,细胞递呈抗原能力采用混合淋巴细胞反应(MLR)检测.结果:IL-12p35siRNA转染后的DC表面分子CD80和MHCⅡ表达无明显改变,分泌IL-12减少、分泌IL-10增多,刺激同种T淋巴细胞增殖的能力下降.结论:IL-12p35 siRNA的转染不能干扰DC的成熟,但可以抑制其免疫应答功能.     

STAT3siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3表达和细胞生物学行为的影响

目的:观察经RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌细胞A549生长和凋亡的影响。方法:设计并经化学合成了针对STAT3基因不同位点的3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列(STAT3siRNA1、STAT3siRNA2、STAT3siRNA3),在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR法检测STAT3mRNA表达变化,筛选出抑制作用最强的STAT3-siRNA。免疫印迹法检测细胞STAT3、Cyclin D1、BAX、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达。AM-BLUE法测定A549细胞体外增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:经RNA干扰能有效降低A549细胞STAT3mRNA表达水平(P0.05),转染STAT3siRNA后,A549细胞STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低(P0.05),而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高(P0.05)。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关(r=0.854,0.910,P0.05);与BAX蛋白表达呈负相关性(r=-0.848,P0.05);与Caspase-9蛋白表达呈无相关性(r=-0.787,P0.05)。RNA干扰法沉默STAT3基因表达后,A549细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:STAT3siRNA可有效抑制A549细胞STAT3表达,抑制A549细胞生长并促进其凋亡。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κBp65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景。利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κBp65的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染入小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κBp65mRNA表达,Westernblot检测细胞内NF-κBp65蛋白水平。同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用。结果显示:在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κBp65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κBp65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κBp65的表达也明显受到抑制。说明RNAi技术可以抑制NF-κBp65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法。     

沉默肝脏X受体β表达对BV2小胶质细胞极化的影响

目的探讨沉默肝脏X受体β(LXRβ)对BV2小胶质细胞M1/M2表型变化和炎症因子释放的影响。方法通过RNA干扰技术沉默小鼠小胶质细胞株(BV2)中LXRβ的表达。实验分为siRNA-NC组(siRNA无关序列对照组)、siRNA-LXRβ组(转染siRNA-LXRβ质粒)。转染siRNA-LXRβ后,免疫荧光方法检测LXRβ和Iba1的表达水平;实时荧光定量PCR技术检测LXRβ、炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、小胶质细胞M1型标记物(COX-2、iNOS、CD68)和M2型标记物(Arg-1、CD206)的mRNA水平表达。流式细胞术(flow cytometry)检测小胶质细胞M1型标记物(MHCⅡ、CD36)和M2型标记物(Arg-1、CD206)的表达水平。结果对BV2细胞分别转染24 h、48 h后发现,48 h的siRNA-LXRβ组的LXRβ蛋白及mRNA水平均显著低于NC组(P<0.001)。沉默LXRβ的表达后BV2细胞表现为胞体变圆变大,呈阿米巴样活化状态,炎症因子相关基因TNF-α、IL-6的mRNA表达水平显著升高(P<0.01),同...     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

干扰IL-8表达对乳腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响

目的探究IL-8对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学特性的影响以及作用机制。方法将siRNA IL-8转染至乳腺癌细胞中,实验分为空白对照组、阴性对照组、siRNA1 IL-8组、siRNA2 IL-8组。噻唑蓝(MTT)实验观察干扰IL-8基因表达对细胞活力的影响,Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力的变化,采用荧光定量PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测转染后IL-8 mRNA和蛋白水平,蛋白质印迹法(Western blot)法检测Wnt/β-catenin信号通路的变化。结果与空白对照组相比,siRNA1 IL-8组、siRNA2 IL-8组乳腺癌细胞中IL-8 mRNA和蛋白表达量显著下降(P0.05);siRNA2 IL-8组细胞中IL-8 mRNA和蛋白水平较siRNA1 IL-8组显著下调(P0.05),表明siRNA2 IL-8的干扰效果较强,因此用于后续实验。干扰IL-8表达对抑制乳腺癌细胞的活力无显著影响,抑制其侵袭、迁移能力(P0.05),细胞中β-catenin、MMP-2、MMP-9的蛋白水平显著降低(P0.05)。结论干扰IL-8表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移能力。     

下调SLP-2基因表达抑制脑胶质瘤细胞增殖及诱导凋亡的机制研究

目的：探讨下调人Stomatin like protein 2(SLP-2)基因表达对脑胶质瘤细胞增殖凋亡的影响。方法：SLP-2的靶向siRNA序列转染人脑胶质瘤U251细胞（SLP-2敲低组）,另设空白组（细胞未做任何处理）和阴性对照组（细胞转染无义siRNA序列）,转染48 h后Western blot检测各组细胞中SLP-2、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Notch1、Hes1的蛋白表达;CCK8检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：阴性对照组SLP-2的蛋白表达与空白组差异无统计学意义（P>0.05）,而SLP-2敲低组SLP-2的蛋白表达显著低于空白组（P<0.05）;阴性对照组细胞存活率、细胞凋亡率、IL-6和TNF-α的mRNA表达及Bcl-2、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达与空白组差异无统计学意义（P>0.05）,而SLP-2敲低组细胞存活率、IL-6和TNF-α的mRNA表达及Bcl-2、Notch1、Hes1的蛋白表达显著低于空白组,细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于空白组（P>0.05）。结论：下调SLP-2基因表达可显著抑制脑胶质瘤细胞增殖及诱导细胞的凋亡,下调炎症细胞因子IL-6和TNF-α的表达,其机制与抑制Notch1信号通路有关。     

沉默癌胚抗原相关细胞黏附分子1基因抑制SHG44人胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡

目的采用RNA干扰技术(RNAi)沉默癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)基因的表达,观察沉默效果及沉默CEACAM1表达后对SHG44人胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并化学合成针对CEACAM1的3对小干扰RNA(siRNA),脂质体法瞬时转染SHG44细胞。流式细胞术(FCM)检测转染效率,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测siRNA转染前后SHG44细胞中CEACAM1 mRNA的表达,Western blot法检测CEACAM1蛋白的表达。CCK-8法检测SHG44细胞细胞增殖活性,annexin V-FITC/PI染色结合FCM检测SHG44细胞凋亡,Western blot法检测cleaved caspase-3和裂解型多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)的变化。结果 CEACAM1 siRNA转染效率达85%。与空白对照组和阴性对照组比较,qRT-PCR及Western blot结果显示,3组特异性siRNA转染48 h后,在mRNA和蛋白水平上CEACAM1的表达均降低,以CEACAM1-siRNA3效果最明显。siRNA组SHG44细胞的增殖能力较正常对照组明显下降,凋亡细胞比例增加。沉默CEACAM1表达可以上调cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达。结论沉默CEACAM1基因表达可有效抑制SHG44胶质瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

STAT3在肝细胞增殖过程中对C/ebpβ表达的影响

目的探讨STAT3在IL-6刺激肝细胞增殖过程中对C/ebpβ表达变化的影响。方法用含15 ng/ml的IL-6培养基培养大鼠正常肝细胞BRL-3A,运用CCK试剂盒检测该细胞在IL-6刺激后不同时间里的增殖情况,Western blot技术检测STAT3、P-STAT3、C/ebpβ的蛋白表达变化情况;利用siRNA瞬时转染技术抑制STAT3在BRL-3A细胞中的表达并观察IL-6刺激肝细胞增殖过程中C/ebpβ的表达变化。结果 IL-6能有效的刺激肝细胞增殖,在增殖早期STAT3、P-STAT3、C/ebpβ表达均明显上调;在肝细胞增殖过程中沉默STAT3后C/ebpβ表达下调。结论在IL-6肝细胞增殖过程中STAT3对C/ebpβ起正向调控作用。     

RNA干扰对人肺泡上皮A549细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达抑制作用

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)干扰对人肺泡上皮A549细胞株MIF基因表达的影响.方法将MIF siRNA用转染剂Interferin介导转染体外培养的A549细胞,通过RT-PCR方法观察不同浓度MIF siRNA转染后,对MIF mRNA表达的影响;采用细胞免疫荧光方法分析MIF蛋白表达的强弱;应用MTT方法测定MIF siRNA转染对细胞的毒性,及脂多糖(LPS)刺激对A549细胞生存率的影响.结果 (1)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,可下调细胞中MIF mRNA的表达,只有当MIF siRNA转染浓度大于50 nmol/L时,才能明显下调MIF mRNA的表达;(2)MIF siRNA转染人肺泡上皮A549细胞株后,A549细胞MIF的荧光蛋白表达也明显降低,在此基础上再加入MIF刺激,MIF的蛋白表达又明显增加;(3)MIF siRNA转染对A549细胞几乎没有毒性,且对LPS刺激A549细胞导致细胞死亡及细胞的生存率下降有一定的保护作用.结论 MIF siRNA能在A549细胞特异沉默目的基因MIF和抑制MIF蛋白的表达,且对LPS刺激导致细胞死亡有一定的保护作用.     

RNA干扰抑制MyD88表达对小鼠骨髓树突状细胞生物学活性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓树突状细胞(DC)髓样分化因子88(MyD88)的表达,并检测其对细胞生物学活性的影响,为DC的临床应用奠定基础。方法:针对MyD88基因,采用化学合成法合成3对MyD88 siRNA(序列1、序列2及序列3),并转染DC2.4细胞。采用半定量RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测DCMyD88的表达情况,筛选其中一对高效RNA(序列3)转染DC2.4细胞(RNA干扰组),以未转染RNA的DC2.4细胞作为对照组,分别给予1 mg/L的脂多糖(LPS)刺激。流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的变化,ELISA法检测DC分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-12(IL-12)的浓度,免疫细胞化学检测DC核因子-κB(NF-κB)的表达,混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力,观察RNA干扰对LPS促DC成熟的影响。结果:与空白对照组相比,序列2组及序列3组DC的mRNA和蛋白质表达分别降低90%和85%、92%和88%,差异有统计学意义;脂质体对照组、无义siRNA对照组及序列1组DC的mRNA和蛋白质表达无显著差异。经LPS刺激后,与对照组相比,RNA干扰组CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表达,TNF-α、IFN-γ及IL-12的浓度及T细胞增殖能力均显著下降,且未见明显NF-κB核转位。结论:RNA干扰技术能显著下调小鼠DC MyD88的表达,并显著抑制LPS促DC成熟的效应,为以DC MyD88为靶向、相关疾病的基因治疗提供了新思路和手段。     

金黄色葡萄球菌α-toxin(Hla)促进皮肤组织中IL-19表达上调的作用机制研究

目的探究金黄色葡萄球菌α-toxin(Hla)促进皮肤组织中IL-19表达上调的作用机制。方法采用WT S.Aureus、△Hla S.aureus(Hla缺失菌株)以及PBS感染Balb/c小鼠背部皮肤,收集感染后第1、3、7天的皮肤组织,HE染色检测组织炎性病理损伤,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-19、IL-1β的m RNA和蛋白水平的表达。分离小鼠骨髓的中性粒细胞,分别用WT S.Aureus、△Hla S.aureus以及meida(不含菌液的培养基)刺激6 h后,q RT-PCR、ELISA和Western blot检测IL-1β的表达。不同浓度IL-1β刺激角质形成细胞PAM 2-12后,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-19的表达。结果△Hla S.aureus组与WT S.aureus组相比,其皮肤损伤的面积减小,炎性细胞浸润和脓肿形成减少。同时q RT-PCR和ELISA检测发现,△Hla S.aureus组与WT S.aureus组相比,IL-19的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P0.01)。体外中性粒细胞刺激发现,△Hla S.aureus组与WTS.aureus组相比,IL-1β蛋白表达水平显著降低(P0.01)。体外IL-1β刺激角质形成细胞PAM 2-12发现,与不刺激组相比,IL-19的m RNA和蛋白表达水平显著增加(P0.01),并呈剂量依赖性。结论金黄色葡萄球菌分泌的α-toxin能够作用于中性粒细胞,促进了IL-1β的表达,IL-1β的过表达作用于皮肤的角质形成细胞,从而促进了IL-19的上调,可能参与了银屑病的发生与发展。     

HMGB1RNAi抑制TGF-β1诱导的A549细胞系EMT

目的探讨HMGB1在肺泡上皮细胞间质转分化中的作用。方法设计并合成针对HMGB1的小干扰RNA(siRNA),体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞,将细胞分为4组:1)对照组,2)TGF-β1刺激组,3)RNAi组(TGF-β1+HMGB1 siRNA),4)RNAi阴性对照组(TGF-β1+siRNA阴性对照);倒置相差显微镜观察细胞形态学;RT-PCR法检测HMGB1和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达;Western blot法检测α-SMA和HMGB1蛋白表达。结果 TGF-β1刺激组细胞HMGB1和α-SMA的mRNA和蛋白表达均较对照组显著增加(P0.01);RNAi组HMGB1、α-SMA mRNA和蛋白表达均较正常对照组显著下降(P0.01)。结论 HMGB1可能参与了TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞转分化。