CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响

CYP7A1（cholesterol 7α-hydroxylase ）在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达, 利用荧光素酶作为报告基因,将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3 basic质粒载体中,再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明,2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列,含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示,当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示,CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达,其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.     

家蚕滞育关联山梨醇脱氢酶基因的启动子活性分析

【目的】明确家蚕Bombyx mori滞育关联基因山梨醇脱氢酶基因BmSDH(BmSDH-1,BmSDH-2a和BmSDH-2b)的转录特性。【方法】用5'RACE技术确定家蚕3个BmSDH基因的转录起始位点。利用PCR技术克隆3个BmSDH基因约1 kb及BmSDH-2a不同长度的启动子区序列,分别构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的载体pGL3-BmSDH-P-luc,并与pRL-CMV报告质粒(含海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕BmN细胞,通过双荧光素酶检测系统检测BmSDH基因启动子活性;分别在BmN细胞培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素和滞育激素,通过双荧光素酶检测系统检测不同浓度激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。【结果】BmSDH-1的转录起始位点为A(-41),BmSDH-2a的转录起始位点为C(-41),BmSDH-2b的转录起始位点为A(-40)(翻译起始位点为+1)。双荧光素酶检测结果表明,BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,BmSDH-2a 355 bp长度片段的启动子活性极显著高于674 bp和1 117 bp长度片段。用不同浓度滞育激素处理BmN细胞后,BmSDH-2a的1 117 bp启动子活性随着滞育激素浓度的升高有上升的趋势,当浓度高于100 ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平;用保幼激素进行处理后,随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低;蜕皮激素处理后,0.1 ng/mL激素显著增强启动子活性,当激素浓度继续升高启动子活性逐渐降低。【结论】确定了BmSDH基因的转录起始位点。BmSDH-2a启动子活性显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,一定浓度的蜕皮激素能显著提高BmSDH-2a启动子活性。研究结果有助于阐明BmSDH基因在家蚕滞育中的功能。     

猪ANK1基因单核苷酸多态性与启动子区域活性分析

本实验旨在通过构建猪ANK1基因启动子序列的双荧光素酶报告基因系统,分析ANK1基因启动子活性,寻找ANK1基因启动子的核心区域,为下一步研究猪ANK1基因启动子序列SNP与活性之间的关系提供依据。利用Methprimer和Ali Baba2.1软件预测分析ANK1基因启动子区序列,预测其转录结合位点和Cp G岛。利用直接测序法,对广西巴马小型猪和长白猪共64个样品的ANK1基因启动子核心区域的单核苷酸多态性进行研究。双荧光素酶实验结果表明所预测的序列具有启动子活性,并寻找到启动子的核心区域;同时发现了16个SNP位点,它们分别是:-19、-133、-147、-187、-228、-246、-332、-360、-369、-468、-549、-550、-615、-696、-725和-798。     

人FAM33A基因启动子的克隆与鉴定

目的鉴定人FAM33A基因的启动子,为进一步研究其转录调控机制奠定基础。方法采用5’RACE技术（5’端cDNA快速扩增）鉴定FAM33A的转录起始位点。采用PCR定向克隆、酶切亚克隆等策略,构建FAM33A启动子荧光素酶报告基因。采用Lipofeetamine^TM2000转染H1299细胞,并通过Dual-Lu-ciferase@ Reporter Assay System进行荧光素酶报告基因活性检测。结果确定了FAM33A的转录起始位点,构建了覆盖FAM33A 5’端ATG附近约2kb区域的一系列FAM33A启动子荧光素酶报告基因。启动子活性分析表明,这些重组体均具有较高的启动子活性,同时含有典型的GC盒以及Sp1、E2F和GATA-1等潜在的转录因子结合位点。结论FAM33A启动子区域主要定位于转录起始位点附近约590bp的区域内。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析

Laryngeal carcinoma related gene 1(LCRC1)是一个喉癌候选抑瘤基因,为进一步深入研究其转录调控机制,应用5'RACE技术确定了该基因的转录起始位点,然后在对人LCRG1基因进行生物信息学分析的基础上,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了11种含不同长度LCRG1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,-169～ 127区域的启动子活性最高.研究提示,LCRG1基因转录所必需的基因启动子序列在-169～ 127范围内.     

棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2核心启动子区缺失分析

CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制, 对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1 095~+43)的重组质粒, 转染Sf9细胞瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。功能分析结果表明: 所有的7个缺失片段均具有启动子活性, -197~+43启动子区域的转录活性最高。在CYP9A17v2基因5′-调控区-197~-113区域内可能存在转录增强因子的结合位点, 而在-1 095~-197区域内可能存在转录抑制因子的结合位点。本研究为探索棉铃虫CYP9A17v2过量表达的转录调控机理奠定了重要基础。     

抑瘤基因NGX6启动子的克隆与功能鉴定

NGX6是一个结直肠癌候选抑瘤基因,其转录调控机制不明．采用生物信息学技术预测其启动子区,并构建NGX6启动子荧光素酶报告基因重组体pGL3/Enhancer/1126．荧光素酶活性检测结果表明该区域具有强启动子活性．应用PromoterInspector program,FistEF,CpGplot和MatInspector Professional软件分析发现,NGX6基因转录调控区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区．凝胶迁移阻滞实验确定NGX6基因启动子区域具有Sp1特异性结合位点,Sp1特异性阻断剂光神霉素(mithramycin A)能明显抑制NGX6启动子的活性和NGX6基因的表达;封闭内源性Sp1能下调NGX6基因mRNA表达水平．     

人连接蛋白43基因启动子活性区域分析

利用PCR技术从基因组DNA中获得不同长度的Cx43基因启动子片段,克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成纤维细胞,通过荧光素酶活性检测,分析不同启动子区域的转录调控能力。结果显示Cx43基因不同长度的启动子荧光素酶报告基因载体被成功构建,它们在成纤维细胞中的活性不同:535~-1区域可能为Cx43基因启动子的核心转录调控作用区,这为进一步研究Cx43在成纤维细胞中的转录调控特点奠定了基础。     

儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析

Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于-88~+156 bp,-88~-73 bp和+156~+149 bp可增强启动子活性,+229~+419 bp可抑制启动子活性,且-84~-63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。     

小鼠精胺氧化酶基因启动子结构和功能研究

目的:克隆和鉴定小鼠精胺氧化酶(mSMO)启动子DNA序列.方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总RNA,应用5'-RACE法获得mSMO的转录起始位点;巢式PCR方法克隆含有mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5'端系列截短的mSMO启动子荧光素酶报告质粒;将报告质粒瞬时转染Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性.结果:确定mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中.克隆获得mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5'端系列截短的启动子报告质粒.报告基因分析证实,该上游DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低.结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176～+124bp为mSMO核心启动子区,-615～-176bp区为重要的转录调控区.     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析

Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于?88~+156 bp,?88~?73 bp和+156~+149 bp可增强启动子活性,+229~+419 bp可抑制启动子活性,且?84~?63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。     

人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。     

NFY结合位点缺失下调NPCEDRG基因启动子转录活性和效率

NPCEDRG基因是一个鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)相关基因. NPCEDRG基因启动子为TATA-less启动子,其核心启动子区域位于-146 ～-8 bp区,该区域包含NFY、STAT1和cMYB等转录因子结合位点. 前期研究结果提示,转录因子NFY可能参与NPCEDRG基因的转录调控. 为明确NFY转录因子在NPCEDRG基因转录中的作用,本研究应用报告基因载体系统分析方法对NPCEDRG基因核心启动子区进行NFY结合位点（或CCAAT-box）缺失突变及其功能分析,分别构建NPCEDRG基因核心启动子区NFY结合位点缺失突变的Luc和EGFP报告基因表达载体. 比较核心启动子和NFY结合位点缺失突变体报告基因载体的转录活性和效率. 结果表明,在MCF7和CNE2细胞中,NFY结合位点缺失突变体的转录活性分别约为其核心启动子转录活性66.94%和75.72%,即NFY结合位点缺失致使该启动子转录效率在MCF7和CNE2细胞中分别降低了33.06%和24.28%;EGFP报告基因表达载体系统研究结果与Luc报告基因载体系统结果基本吻合. 本研究再次证实,转录因子NFY通过结合NPCEDRG基因启动子的核心元件NFY结合位点参与NPCEDRG基因的转录调控,并提高其基因转录活性和效率.     

白介素18启动子区基因多态性与儿童EV71感染相关性研究

目的:研究白介素18基因启动子多态性与儿童EV71感染遗传易感性的关系.方法:收集EV71感染患儿177例,单纯HFMD组127例,HFMD并脑炎组50例,提取外周血DNA,用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)技术及基因测序法检测IL-18启动子区-137G/C、-607A/C位点的基因多态性.结果:EV71感染患儿与健康儿童IL-18-607基因型以CA为主,AA、CC次之,EV71感染患儿AA基因型、A等位基因分布频率显著高于健康儿童.EV71感染HFMD并脑炎组患儿AA基因型分布显著高于单纯HFMD组患儿,差异有统计学意义.EV71感染患儿与健康儿童IL-18-137基因型以CC为主,CG次之,GG占少数.该位点基因型及等位基因在EV71感染组与健康儿童、单纯HFMD与HFMD并脑炎组的分布无显著差异.结论:IL-18基因多态性与EV71感染相关,IL-18-607AA基因型、A等位基因携带儿童更易感染EV71病毒,且AA基因型患儿易并发脑炎,-607AA基因型可能为EV71感染的易感基因型.-137C/G位点基因多态性与EV71感染无相关性.     

Mip1对大鼠心肌细胞凋亡基因Bid转录调控作用的初探

目的:研究转录因子Mip1对大鼠心肌细胞H9C2凋亡相关基因Bid的转录调控作用.方法:以H9C2细胞基因组DNA为模板,扩增Bid核心启动子片段,将其克隆入荧光素酶报告基因质粒PGL3-Basic中,构建重组载体,并采用双酶切法、PCR法及基因测序对其进行鉴定.用脂质体转染法将该载体转入Mip1不同程度过表达的H9C2细胞,检测该细胞Bid基因启动子区的转录活性.结果:成功克隆Bid基因启动子区,双酶切、PCR和基因测序均显示PGL3-Basic-Bid promoter重组载体构建成功.荧光素酶相对活性检测显示在H9C2细胞中,随着Mip1转入的增多,Bid启动子区转录活性逐渐下降.结论:Mip1作为一个新的转录抑制因子,可以下调凋亡基因Bid的转录.     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

PLAGL2与SP—C基因启动子相互作用的研究

目的研究PLAGL2（pleiomorphic adenoma genelike-2,PLAGL2）对SP-C基因（surfactant pro-tein—C,SP—C）启动子的结合与影响作用。方法定点诱变技术（site—directed mutagenesis）及凝胶电泳迁移实验（electrophoresis mobility shiftassay,EMSA）研究PLAGL2与SP—C基因启动子之间的相互结合作用;体外培养MLE12细胞共转染和荧光素酶报告基因活性值检测技术,研究PLAGL2对SP—C基因启动子表达活性的影响;结果EMSA及竞争性EMSA实验表明：PLAGL2能通过其核心和簇结合位点序列与同位素标记的SP—C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物;细胞共转染及荧光素酶报告基因活性值检测结果显示：PLAGL2能明显促进SP—C基因启动子的表达。结论在肺Ⅱ型细胞中,PLAGL2能与SP—C基因启动子相互作用并促进其表达。     

斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。