大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。     

重排NAD+合成途径提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性

为提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的催化活性,构建了两个载体分别表达:(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);(2)与NAD+合成相关的关键酶,包括烟酸转磷酸核糖激酶(pnc B)、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(nad D)和NAD+合成酶(nad E)。将这两个载体共转化大肠杆菌,获得重组菌E.coli(p ET-pepcp UC-pnc B-nad D-nad E)。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示这些酶均实现了高表达。摇瓶发酵显示,与单独过表达PEPC的重组菌相比,双质粒工程菌的PEPC酶活提高了4.36倍;与野生型大肠杆菌相比,双质粒工程菌的琥珀酸产量提高了4.23倍,达到0.9 g/L,富马酸产量提高了5.23倍,达到5.4 mg/L。上述结果表明加强NAD+合成途径提高了PEPC活性,并增加了还原三羧酸循环的代谢流量。     

基于氧化还原酶活性时变研究巴利阿里假单胞菌中心碳代谢

以分离自中国北部湾沉积物的海洋菌株巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)为例,在考察其生长动力学的同时,监测了其中心碳代谢(CCM)中6种关键氧化还原酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶及异柠檬酸脱氢酶的酶活性时变,从酶蛋白表达水平揭示了海洋生长条件下巴利阿里假单胞菌CCM中关键氧化还原酶的酶活性变化的规律,为研究微生物CCM和发掘海洋微生物新型酶制剂提供一种新思路.     

钝齿棒杆菌B-9有关谷氨酸合成途径的研究

实验测定了B-9菌二级种子和三个发酵时期的无细胞制剂的若干种酶的活性。NADPH联系的谷氨酸脱氢酶、谷丙和谷草转氨酶均有显著活性,种子缺天冬氨酸酶活性。NADPH联系的谷氨酸合成酶活性接近于谷氨酸脱氢酶活性的1/10。谷氨酸合成途径,应以谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸氨化作用为主;但谷氨酸合成酶和天冬酶酸酶也可能参予作用。葡萄糖降解类似于其它生产菌株,通过EMP途径和HMP歧路。存在乙醛酸旁路,α-酮戊二酸氧化活力弱。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和依赖于NADP的苹果酸酶活性均低。     

家驴乳酸脱氢酶同工酶M_4和H_4的分离与性质

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,EC 1.1.1.27;简称LDH)是机体代谢中一个很重要的酶,它催化下述反应: 丙酮酸+NADH+H~+乳酸+NAD~+ 现已明瞭,大多数动物体内的LDH含有五种同工酶,它们是由两种亚基(H与M)按不同组合形成的四聚体,其中LDH-1和LDH-3分别由四个H亚基和四个M亚基组成。后来在很多动物睾丸和精子中又发现了另一种LDH同工酶,命名为LDH-X,它由四个X亚     

增强谷氨酸棒状杆菌羧化途径对有机酸产量的影响

以谷氨酸棒状杆菌CZ04为出发菌株,利用pK19mobsacB载体的反向筛选,通过在ppc和pyc基因前面敲入超氧化物歧化酶基因启动子(Psod),相应获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)上调的重组菌株CZ05和丙酮酸羧化酶(PYC)上调的重组菌株CZ06以及PPC、PYC双上调的重组菌株CZ07,并研究了增强谷氨酸棒状杆菌羧化途径对有机酸产量的影响。结果表明,强启动子的敲入,对菌株生长没有明显影响,但增强了谷氨酸棒状杆菌的羧化代谢途径,能促进转基因菌株中有机酸的生成和积累。     

基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

浅谈CAM植物

自然界,绿色植物区别于其他生物的最主要的特点就是它的自养性,进行光合作用,在光下同化CO_2和H_2O合成碳水化合物.光合作用中,CO_2的同化途径因植物类型和生态环境的不同而不同.共有三条,即卡尔文循环(C_3途径)、C_4——二羧酸途径(C_4)途径和景天科植物酸代谢途径(CAM途径),具有这些光合碳同化途径的植物分别称为C_3植物,C_4植物和CAM植物.其中C_3植物,C_4植物种类繁多,广泛存在于自然界,研究的比较透彻,大家都很熟悉.而CAM植物由于研究历史短,日常所见种类少,还鲜为人知,但它是一类代谢类型比较特殊的植物.为此,本文对它作一介绍.     

铁皮石斛生理生化性质的研究

对兰科植物铁皮石斛的生理生化特性进行了研究,并将其与典型的C3 植物大豆、C4 植物玉米、景天酸代谢(CAM)植物仙人掌进行了对比实验 从实验结果来看,铁皮石斛的叶绿素a/b值较低,pH变化与仙人掌非常相似:白天都是从低到高,夜里都是从高到低 有机酸含量有昼夜波动 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性较大豆略高     

几种沙生植物光合碳代谢途径关键酶的研究

研究了分布于甘肃省临泽地区的沙拐枣、珍珠、霸王、泡泡刺、胡杨等５种沙生植物的光合酶：果糖－１．６－双磷酸酯酶（ＦＤＰａｓｅ）、１．５－二磷酸核酮糖羧化酶（ＲＵＢＰｃａｓｅ）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰｃａｓｅ）、ＮＡＤ－苹果酸脱氢酶（ＮＡＤ－ＭＤＨ）活性的季节变化。结果表明，珍珠和沙拐枣的ＦＤＰａｓｅ酶活性远低于其它几种材料；珍珠、霸王、沙拐枣的ＰＥＰｃａｓｅ活性明显高于其它两种材料；珍珠、沙拐枣的ＮＡＤ－ＭＤＨ活性明显高于其它三种材料。可见，珍珠、霸王是ＣＡＭ植物，沙拐枣是Ｃ４植物，胡杨是Ｃ３植物，泡泡刺有可能在干旱协迫下由Ｃ３向Ｃ４或ＣＡＭ途径转化。     

中国鲎同工酶组织器官特异性表达

采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了中国鲎6种组织器官(肝胰腺、心脏、肠、鳃、肌肉和黄色结缔组织)的乙醇脱氢酶(ADH)、山梨醇脱氢酶(SDH)、酯酶(EST)、过氧化氢酶(CAT)、天冬氨酸转化酶(AAT)、苹果酸脱氢酶(MDH)和苹果酸酶(ME)等7种同工酶的活性和分布,并对其酶谱的表型进行了分析.结果表明,中国鲎的同工酶系统存在不同程度的组织特异性.乙醇脱氢酶在鳃和黄色结缔组织中不表达;山梨醇脱氢酶在鳃中不表达;酯酶、过氧化氢酶和苹果酸脱氢酶在6种组织器官中均有表达,但表达活性存在差异;而天冬氨酸转化酶Aat-1位点在鳃中不表达.     

维生素对乳酸菌细胞活性和代谢途径相关酶活性的影响

研究了拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)发酵生产乳酸过程中,添加维生素对菌体生长、细胞活性、产酸,以及在碳流代谢中与乳酸生物合成密切相关的4种酶[乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脱氢酶(PDC)和丙酮酸羧化酶(PC)]活性的影响。结果显示:维生素添加促进了菌体生长,使乳酸产量提高了42.47%;同时降低了发酵过程中菌体的死亡率,降低的最大幅度可达53.46%;PFK和LDH的活性比对照有提高,最大幅度达62.30%和126.65%,PDC的活性在发酵中期也有一定的提高,但PC的活性变化很小。实验结果表明:组合维生素的添加可以提高乳酸菌的活性,同时使代谢通量有利于乳酸生成。     

羊草在多云条件下光合及水分生理生态特征研究

使用Li-6400便携式光合测定仪,对自然条件下呼伦贝尔草原羊草的光合及水分生理生态特征进行了研究,结果表明:八月的呼伦贝尔草原多阴云天气,羊草的净光合速率日变化呈现双峰曲线,蒸腾速率曲线与净光合速率表现出一致的趋势.光响应曲线、CO_2响应曲线结果表明:光合速率(P_n)与CO_2浓度(C_(CO_2))之间回归方程为P_n=-0.09051+0.03865 C_(CO_2)-1×10~(-5) C_(CO_2)~2,根据回归方程可求得CO_2补偿点为2.34μmol·m~(-2)·s~(-1),CO_2饱和点为1932.5μmol·m~(-2)·s~(-1).P_n与光合有效辐射(PAR)之间回归方程为P_n=-2.0596+0.02094 PAR-8×10~(-6) PAR2,光补偿点(LCP)为102.36μmol·m~(-2)·s~(-1),光饱和点(LSP)为1308.75μmol·m~(-2)·s~(-1),羊草较高的光补偿点和光饱和点是其适应内蒙古高原高光强环境的表现,也是其成为该地区优势植物的适应对策.     

氮素形态对牛鞭草光合碳同化酶及叶绿素合成的影响

选用根茎型禾草牛鞭草为材料,研究硝态氮、铵态氮对牛鞭草光合碳同化酶、叶绿素合成前体及叶绿素合成的影响,探究不同形态氮与牛鞭草光合碳同化及叶绿素合成之间的关系.研究发现在m(NO_3~--N):m(NH_4~+-N)为1:0和1:1的氮添加条件下,磷酸稀醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、叶绿素合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinate ALA)、胆色素原(Porphobilinogen PBG)、尿卟啉原Ⅲ(UroporphyrinogenⅢ)及叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b均显著高于m(NO_3~--N):m(NH_4~+-N)=0:1与不施氮NO,但是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCo)差异不显著.结果表明:在牛鞭草培养过程中,适量增加硝态氮有利于提高牛鞭草光合碳同化能力及叶绿素合成能力,从而有利于提高光合作用能力,促进其生长及发育.     

两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析

为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84 U/mg和235.14 U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn ~(2+)可以提高MIME1的活性,其中Cu~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Ca~(2+)、Mn~(2+)对MIME1的活性则有抑制作用;Mn~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)和Ca~(2+)对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Cu~(2+)和Zn~(2+)则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.     

碳氮水添加对华北小麦-玉米双季轮作系统碳平衡的影响

研究典型农田生态系统的碳平衡和不同农业措施的影响,对促进农业部门的减排增汇有十分重要的意义。试验在山东省淄博市桓台县进行,共有8个处理,即C_0N_0W_1:空白对照;C_0N_1W_1:常规氮输入+化肥氮+常规灌溉; C_0N_2W_1:氮输入减量+化肥氮+常规灌溉;C_1N_2W_1:氮输入减量+有机肥+常规灌溉;C_2N_2W_1:氮输入减量+有机肥化肥配施+常规灌溉;C_0N_2W_2:氮输入减量+化肥氮+减量灌溉;C_1N_2W_2:氮输入减量+有机肥+减量灌溉;C_2N_2W_2:氮输入减量+有机肥化肥配施+减量灌溉。研究表明,华北高产农田夏玉米季和冬小麦季都表现为大气CO_2的吸收汇,周年NEP为5.99～9.64t C·hm~(-2),周年净生态系统生产力(NEP)固碳量C_1N_2W_1C_2N_2W_1C_2N_2W_2C_0N_2W_1C_0N_1W_1C_1N_2W_2C_0N_2W_2C_0N_0W_1。     

铝胁迫对油菜生长及叶绿素荧光参数、代谢酶的影响

以铝敏感(华油2790,简称华油)和耐性(中双7号,简称中双)油菜品种为材料,在水培条件下,研究了0,50,100和200 μmol/L铝胁迫处理7 d后对油菜根和叶的各项生理指标的影响.结果表明:随着铝处理浓度的增加,油菜的相对根长逐渐减小,华油的抑制率大于中双,但两者相对株高的变化不大;根的总长和总表面积等均随着铝处理浓度的增加而减小,但根系直径在200 μmol/L铝处理时都略有增加;叶的各项指标则变化不大.此外,各项叶绿素荧光参数,如最大荧光(Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/F0)、光化学量子产量(Yield)等均随着铝浓度的增加而降低,而初始荧光(F0)与上述指标的变化趋势相反,中双的变化幅度小于华油.铝处理下,油菜根尖的酸代谢酶--柠檬酸合成酶(CS)、苹果酸脱氢酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和乌头酸酶(ACO)等的活性均高于对照,且随着铝处理浓度的增加而增加.表明铝胁迫对油菜根和叶均造成了一定的伤害,且对根的影响更明显.随着铝浓度的增加,根尖各代谢酶的活性增加,可能是铝胁迫促进了油菜的生理代谢,是对铝毒的一种生理响应机制.     

铅对沉水植物龙须眼子菜光合作用的影响

采用实验室内植物块茎培养沉水植物的实验方法,研究了不同质量浓度Pb2+胁迫下龙须眼子菜的生长状况及光合作用参数的变化.结果表明:随着Pb2+浓度的提高,植株高度受到抑制、叶片黄化、植株根部部分变灰腐烂;叶绿素含量显著降低且与铅浓度呈现显著负相关;核酮糖二磷酸羧化酶活性先升高后降低,酶活性与Pb2+浓度呈显著负相关;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性变化小;碳酸酐酶活性先降低后上升.     

江苏种群橄榄蚶同工酶的生化遗传分析

采用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直平板电泳技术对江苏种群橄榄蚶不同个体的苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶、酯酶、超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶8种同工酶进行分析,得到基本图谱,并对其进行了生化遗传分析．共记录了21个基因座位、38个等位基因,其中有11个基因座位（Me-1、Adh-2、Adh-3、Ldh-1、Ldh-2、Amy-1、Amy-2、Est-2、Sod-2、Cod-1和Cod-2）为多态,多态座位比例（P）为0．5238,该比例接近一般海产无脊椎动物的多态座位比例,表明江苏种群橄榄蚶具有一定的遗传变异能力．     

含酸性磷酸酯—Y(Ⅲ)萃取有机相的研究

本文研究了无助表面活性剂的二—(2—乙基己基)磷酸(HDEHP)和二—(1—甲基庚基)磷酸(DMHPA)—正庚烷(C_7H_(16))—NaOH—H_2O微乳状液萃取稀土YCl_3溶液前后有机相的FTIR光谱的变化。并采用对比的手段,分析了HDEHP和DMHPA与Y(Ⅲ)配位形式、萃取有机相聚集状态、水在萃取过程中变化规律的异同。