白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡与丝裂素激活蛋白激酶信号通路

目的 探讨白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡以及诱导凋亡的信号传导机制｡ 方法 将培养的大鼠肾小管细胞NRK-52E分别与不同浓度(10､ 20､ 30 mg/ml)的去脂无内毒素牛血清白蛋白(BSA)共同孵育6､ 12､ 18和24 h｡透射电镜､共聚焦激光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡｡BSA 20 mg/ml刺激NRK-52E细胞15､ 30､ 60和120 min后, Westen印迹测定p38､氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)活性｡将SB202190(20 μmol/L, p38抑制剂)､SP600125(10 μmol/L, JNK抑制剂)和PD98059(20 μmol/L, ERK抑制剂)分别与白蛋白和NRK-52E细胞共同孵育24 h后检测细胞凋亡｡结果 白蛋白以时间和剂量依赖方式诱导肾小管细胞凋亡｡白蛋白与NRK-52E细胞共孵育后,p38和JNK活性明显升高,ERK活性显著降低｡SB202190和SP600125可分别抑制白蛋白诱导NRK-52E细胞凋亡,而PD98059促进白蛋白诱导的NRK-52E细胞凋亡｡结论 白蛋白以时间和剂量依赖方式诱导肾小管细胞凋亡,而p38和JNK激活与ERK抑制介导了白蛋白诱导的肾小管细胞凋亡｡     

MAPKs信号通路在内皮素-1诱导的牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用研究

目的:研究丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路在内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)诱导的牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化中的调控机制。方法:体外培养牙周膜干细胞,于ET-1处理前分别加入ERK通路抑制剂PD98059,JNK通路抑制剂SP600125,p38α通路抑制剂SB203580。以未作任何处理的牙周膜干细胞为空白对照,以单独加入抑制剂的牙周膜干细胞为阴性对照,用100nMET-1干预不同组牙周膜干细胞14d,通过实时定量PCR及Western blot技术检测细胞Runx2和OCN基因和蛋白的表达情况。结果:ET-1对牙周膜干细胞Runx2和OCN基因及蛋白表达具有显著促进作用,但PD98059抑制了ET-1对牙周膜干细胞Runx2和OCN表达的促进效应,而SP600125和SB203580的抑制作用不显著。结论:ET-1通过ERK信号通路调控牙周膜干细胞Runx2和OCN的表达。     

p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及对成骨细胞分化的调控

 目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中 p38MAPK与 ERK1/2的协同效应及其机制。方法以成骨细胞分化添加剂诱导小鼠 BMSCs向成骨细胞分化,测定碱性磷酸酶活性和钙沉积量。检测磷酸化 p38MAPK和磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平评估通路的激活状况。以 SB203580或 PD98059阻断 p38MAPK或 ERK1/2通路,观察对成骨细胞分化的影响。以 SB203580或亚砷酸钠阻断或激活 p38MAPK通路,观察 p-ERK1/2的变化。以冈田酸抑制蛋白磷酸酯酶 2A(protein phosphatases type 2A,PP2A)活性,观察 p-ERK1/2的变化及对成骨细胞分化的影响。通过免疫共沉淀实验观察 PP2A和 ERK1/2间的结合及 SB203580对结合的影响。结果成骨细胞分化添加剂诱导 BMSCs向成骨细胞分化的过程伴有 ERK1/2和 p38MAPK通路的激活, SB203580剂量±赖性抑制成骨细胞分化,PD98059剂量±赖性增强成骨细胞分化。 SB203580使 p-ERK1/2表达增加,亚砷酸钠减弱其表达。冈田酸使 p-ERK1/2表达增加,并使成骨细胞分化受到抑制。 PP2A可直接与 ERK1/2结合,SB203580使 PP2A与 ERK1/2的结合减弱。结论 p38MAPK可通过 PP2A与 ERK1/2产生协同效应,并调节 BMSCs向成骨细胞分化。     

丝裂原活化蛋白激酶类和蛋白激酶C在转化生长因子β1诱导肾小管细胞结缔组织生长因子表达中的作用

目的了解转化生长因子β1（TGF-β1）诱导肾小管细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达的机制，特别是蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在CTGF基因表达中的作用及其对Smad磷酸化的影响。方法分别应用PKC抑制剂G06850以及MAPK的3个组成成分ERK、JNK和p38MAPK的抑制剂PD98059、U0126、SP600125和SB203580阻断相应通路，观察其对TGF．131诱导的CTGF表达以及Smad2／Smad3磷酸化的影响。结果TGF-β1（5μg／L）以时间依赖方式诱导HK-2细胞中Smad2／Smad3的磷酸化，从基础值0．87±0．09上升至2h时高峰2．350±0.11。PKC抑制剂G06850（5μmol／L）和ERK抑制剂PD98059（10μmol／L）、U0126（10μmol／L）可部分抑制TGF-β1诱导的CTGF表达，而p38MAPK抑制剂SB203580（20μmol／L）和JNK抑制剂SP600125（10μmol／L）对TGF-β1诱导的CTGF的表达无影响。PKC抑制剂G06850（5μmol／L）可减少TGF-β1诱导的Smad2／Smad3磷酸化，而ERK抑制剂PD98059（10μmol／L）和U0126（10μmol／L）对Smad2／Smad3的磷酸化没有影响。结论在肾小管上皮细胞中，TGF-β1诱导CTGF的表达需要PKC和Ras／MEK／ERK的参与。PKC以Smad依赖的方式参与肾小管上皮细胞中TGF-β1诱导的CTGF的表达，而Ras／MEK／ERK对CTGF表达的调节不依赖于Smads。     

丝裂素激活蛋白激酶活化与肾小管上皮细胞生物学行为的关系

目的探讨丝裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号通路对血小板源生长因子(PDGF)诱导肾小管上皮细胞表型转化的作用及其对细胞移行能力的影响.方法以PDGF(20 ng/ml)刺激培养的人近端肾小管上皮HK-2细胞,分别观察细胞形态、增殖和移行能力的变化.采用蛋白免疫印记法检测MAPK各亚类活性及α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达,同时观察分别采用细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38信号通路特异阻断剂PD98059、SP600125和SB203580后上述指标的变化.结果 PDGF刺激6～12 h使α-SMA表达上调近2倍,但刺激24～48 h反而使α-SMA表达低于基础水平.PDGF刺激24 h后HK-2细胞从立方形转变为梭形,细胞虽尚无增殖反应但移行能力增强至3倍(P＜0.01).PDGF诱导的ERK、JNK和p38活性均在2 min时迅速增高,分别在2～5 min达高峰,分别为基础水平的5.7倍、2.6倍和1.6倍(P＜0.05),ERK和JNK活性增高可持续至120 min,而p38活性则于60 min以后恢复至基础水平.在PDGF刺激24 h的情况下,PD98059和SP600125不影响基础状态及PDGF对α-SMA表达的作用,但SP600125可抑制PDGF上调的细胞移行能力(P＜0.01);而SB203580既可抑制α-SMA的基础表达(P＜0.01)及PDGF下调的α-SMA表达(P＜0.001),同时还可显著抑制PDGF诱导的细胞移行能力(P＜0.05).结论 PDGF可刺激MAPK的不同亚类信号通路磷酸化,并可诱导肾小管上皮细胞形态改变及其移行能力增强.在PDGF诱导的表型转化和移行功能改变中,ERK信号通路无介导作用,JNK通路主要与细胞移行能力变化相关,而p38可能是调控α-SMA表达和细胞移行改变的主要信号通路.     

丝裂原蛋白激酶信号转导通路在机械通气相关性肺损伤中的作用

目的观察机械通气介导肺损伤（VILI）过程中丝裂原蛋白激酶（MAPK）的活性变化以及对细胞因子的影响，从中探讨VILI发生机制和MAPK的作用。方法72只SD大鼠随机分为未处理的对照组（不行机械通气）、正常通气组、过度通气组和采用MAPK抑制剂SP600125（JNK）、SB203580（p38）、PD98059（ERK）分别预处理上述3组。机械通气4h后取大鼠肺组织采用Western blot方法测定各组的总JNK、ERK、p-38蛋白激酶的表达及其磷酸化水平变化。同时以酶联免疫吸附试验（EUSA）方法测定大鼠肺组织、支气管肺泡灌洗液（BALF）和血浆中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、巨噬细胞炎性蛋白-2（MIP-2）浓度。结果正常和过度机械通气4h后均能激活JNK、ERK、p38激酶，但以过度通气组为著（P〈0．01）。过度通气组大鼠肺组织、BALF、血浆中的TNF-α、MIP-2含量显著高于其他组（P〈0．01）。JNK、ERK、p38抑制剂显著降低肺组织、BALF中的TNF-α、MIP-2含量（P〈0．05或0．01），且JNK和ERK抑制剂作用强于p38抑制剂。结论过度机械通气激活了肺细胞中的JNK、ERK、p38激酶，且JNK、ERK、p38参与了VILI细胞因子的产生，即MAPK信号转导通路的激活可能是VILI发生机制之一。     

转化生长因子β1对肾小管上皮细胞中结缔组织生长因子基因启动子活性的影响

目的探讨转化生长因子[β1（TCF-β1）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2中结缔组织生长因子（CTGF）基因启动子活性的调控作用，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径对该生长因子作用的影响。方法构建含有人类CTGF基因启动子的报告基因pCTGF-luc，将其瞬时转染HK-2细胞。通过检测荧光素酶的活性观察TGF-β1和MAPK途径抑制剂对CTGF基因启动子活性的影响。结果TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子的活性。最佳刺激浓度是5ng／ml，最佳刺激时间为12h，荧光素酶相对活性分别为对照组的1．82倍和2．10倍（P〈0．05）。应用PD98059、SB203580和SP600125分别特异性抑制MAPK途径的胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、蛋白激酶p38（p38MAPK）和c-Jun-氨基末端激酶（JNK）通路，对TGF-β1上调CTGF启动子活性的作用有不同影响。PD98059显著增加HK-2中pCTGF-luc的基础活性．并在一定浓度范围内（0．5～10μmol／L）促进TGF-β1的上调作用。SB203580对pCTGF-luc基础活性无影响，但以剂量依赖方式显著抑制TGF-β1的激活效应。而SP600125对基础状态和TGF-β1刺激下CTGF基因启动子活性无影响。结论TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子活性，在转录水平调节CTGF表达。MAPK途径的ERK和p38MAPK通路可影响TGF-β1的这一调控作用。     

JNK和TGF-β信号途径协同介导CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中过度表达

目的:比较结缔组织生长因子(CTGF)在瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常真皮成纤维细胞(NF)中的表达以及对血清刺激的反应;研究介导CTGF在KF中表达的信号途径.方法:在血清刺激前30 min给予小分子人工合成的信号通路抑制剂预处理,分别为:P13K抑制剂wortmannin(100nM);ERK抑制剂PD98059(50mM);p38 MAPK抑制剂SB203580(10mM);JNK抑制剂SP600125(25 mM);以及TGF-β I型受体抑制剂SB431542(0.1μM、0.5 μM、1μM和10 μM),空白对照组仅加入溶剂DMSO预处理.使用定量实时反转录聚合酶链反应比较CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常皮肤来源的成纤维细胞(NF)中的表达.结果:KF血清刺激后CTGF的表达迅速升高,而在NF血清刺激后仅少量上升.JNK抑制剂SP600125和TGF-β I型受体抑制剂SB431542对CTGF表达的升高具有显著的抑制作用(P＜0.05).结论:KF中的CTGF血清反应需要JNK和TGF-β信号途径的协同作用.     

丝裂原活化蛋白激酶对大鼠成骨细胞TRPV6表达的影响

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶对大鼠成骨细胞瞬时性受体电位香草精受体6（transient receptor poten-tial vanilloid receptor 6,TRPV6）表达的影响。方法采用Wistar大鼠乳鼠,连续酶消化法提取成骨细胞并培养。根据组织形态学、改良Kaplow氏成骨细胞碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染等方法进行鉴定。实验分组：a）正常对照组;b）PD组（PD98059 5μmol/L;PD98059 10μmol/L;PD98059 20μmol/L）;c）SB组（SB203580 5μmol/L;SB20358010μmol/L;SB203580 20μmol/L）;d）PD＋SB组（PD98059 5μmol/L＋SB203580 5μmol/L;PD98059 10μmol/L＋SB203580 10μmol/L;PD98059 20μmol/L＋SB203580 20μmol/L）。细胞计数法、MTT法检测细胞活性,RT-PCR检测成骨细胞TRPV6 mRNA。所得数据用x-±s表示,采用t检验进行统计学分析。结果随着PD98059和/或SB203580浓度的增加,细胞增殖活性有下降的趋势,二者联合作用时细胞活性低于二者单独作用。细胞计数法检测显示,PD98059与SB203580联合作用时,三种组合中细胞数均显著低于空白对照组,P〈0.01;同时也明显低于二者单独作用组细胞数量。碱性磷酸酶染色显示,联合用药组较单独用药细胞数明显减少,细胞体积变小,突起狭长,ALP染色阳性颗粒减少,随药物作用浓度增加上述变化更加显著。茜素红染色显示,钙结节与对照组比较数量少、体积小;10、20μmol/L联合作用组,细胞数减少更加明显,无钙结节形成。SB203580与PD98059二者联合应用显著抑制TR-PV6 mRNA的表达,5 mmol/L联合作用组即可明显抑制,随着作用浓度增加TRPV6 mRNA的表达量逐渐减少。结论 p44/42途径阻断剂PD98059能抑制成骨细胞增殖,明显降低成骨细胞TRPV6 mRNA表达,减少钙结节形成。p38途径阻断剂SB203580能抑制成骨细胞增殖,明显降低成骨细胞TRPV6 mRNA表达,减少钙结节形成。PD98059与SB203580在抑制成骨细胞增殖、降低成骨细胞TRPV6 mRNA表达、减少钙结节形成的作用方面存在协同作用。     

丝裂原活化蛋白激酶在机械通气过程中对肺表面活性物质及特异蛋白基因表达的影响

目的 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在机械通气过程中对肺表面活性物质及特异蛋白基因表达的影响和可能机制. 方法 采用健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只,体重250 g～320 g.采用3％戊巴比妥35 mg/kg～40 mg/kg腹腔注射麻醉后行气管切开置管术,完全随机分组方法分为6组(每组8只):①C组(对照组,麻醉后仅做气管切开不做机械通气)；②LV组[正常通气组,潮气量(Vt):6ml/kg,余同过度通气组]；③HV组[过度通气组,Vt:40 ml/kg,呼吸频率(RR)40次/min,吸呼比(I∶E)1∶2～1∶3,呼气末正压通气(PEEP) =0,吸入氧浓度(FiO2)21％,通气4 h]；④SP600125组(SP600125+ HV组,高潮气量通气前30 min给予MAPK拮抗剂SP600125)；⑤PD98059组(PD98059+ HV组,高潮气量通气前30 min给予MAPK拮抗剂PD98059)；⑥SB203580组(SB203580+ HV组,高潮气量通气前30 min给予MAPK拮抗剂SB203580).机械通气4h后(对照组气管切开后4h),采用RT-PCR方法测定肺表面活性蛋白(SP)-A、B、C和RTI40 mRNA表达量. 结果 ①与C组比较,LV组、HV组大鼠肺组织中RTI40表达均增加(P＜0.05),而HV组、SP600125 +HV组及SB203580+HV组肺组织中SP-A、SP-C表达均减少(P＜0.05),LV组中和PD98059+HV组中的SP-A、C变化均无统计学意义(P＞0.05)；②与HV组比较,SP600125+HV组、PD98059+HV组、SB203580+HV组肺组织中SP-A、C基因表达增加(P＜0.05),RTI40基因表达降低(P＜0.05)；③SP-A、C基因表达量在PD98059+HV组较SP600125+HV组、SB203580+HV组升高(P＜0.05)；④SP-B在各组中变化无统计学意义(P＞0.05). 结论 高潮气量机械通气致肺上皮细胞特异蛋白SP-A、C基因表达下降和RTI40基因表达上调,而MAPK拮抗剂可以防止该现象发生,提示MAPK影响呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)过程中对肺上皮细胞的分泌功能.     

两种不同病理类型肾病患者尿蛋白诱导肾小管上皮细胞上调表达趋化因子及其分子信号机制研究

目的 观察不同病理类型肾病患者尿蛋白对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）分泌趋化因子的影响并探讨其分子信号机制。 方法 所有患者均经临床和肾穿刺活检确诊为原发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）或微小病变性肾病（MCD）。以超滤法浓缩提取患者尿中总蛋白，分别刺激体外培养的HK-2细胞。RT-PCR检测调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子（RANTES）及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的mRNA水平。免疫荧光、ELISA及流式细胞仪检测蛋白水平的表达。Western 印迹法检测p38 MAPK和胞外信号调节激酶（ERK）水平。特异性抑制剂SB203580抑制p38磷酸化；PD98059则用于抑制ERK磷酸化。 结果 两种尿蛋白成分有差异，FSGS患者尿蛋白中含有更多的大分子量蛋白。两种尿蛋白均刺激HK-2细胞RANTES及MIF表达上调，而FSGS患者尿蛋白刺激作用更强。两种尿蛋白均显著激活HK-2细胞内ERK和p38 MAPK信号通路。特异性抑制剂分别抑制ERK或p38 MAPK的活化后，FSGS患者尿蛋白介导的RANTES和MIF的上调表达作用可被SB203580或PD98059抑制，而MCD患者尿蛋白的刺激作用却仅能被SB203580所阻断。 结论 FSGS肾病患者的尿蛋白比MCD患者的尿蛋白有更强的上调HK-2细胞RANTES及MIF表达的作用。两种尿蛋白介导趋化因子上调表达的分子信号机制存在差异。     

17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬诱导前列腺癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究

目的探讨17β雌二醇(E2)、他莫昔芬(TAM)和雷洛昔芬(RAL)对前列腺癌PC3凋亡、细胞周期的影响及作用机制。方法检测不同浓度E2、TAM、RAL作用于PC3细胞不同时间后细胞生长抑制率和48 h后细胞周期分布、凋亡率、bcl-2和Caspase-3蛋白的表达,以及12 h后p21WAF1 mRNA．表达。Hoechst染色和电镜观察细胞凋亡。结果E2、TAM、RAL呈时间及浓度依赖性抑制PC3细胞增殖。10-4 mol／L E2、10-5 mol／L TAM和10-5 mol／L RAL作用48 h后检测到凋亡,凋亡率分别为(21．54±0．91)％、(38．28±1．16)％、(42．41±2．26)％(P<0．05),bcl-2和Caspase-3分别为对照组的0．5、0．4、0．35倍;1．4、1．6、1．6倍。细胞阻滞在G1期。对照组和处理组p21WAF1基因表达强度分别为1．12、3．31、5．24、4．48。结论E2、TAM、RAL可以增强p21WAF1基因表达使PC3阻滞于G1期,通过下调bcl-2蛋白并上调Caspase-3蛋白诱导PC3凋亡。     

In vitro evidence for role of ERK, p38, and JNK in exocrine pancreatic cytokine production

Elucidation of mechanisms of acinar cell cytokine production is essential for a better understanding of acute pancreatitis pathogenesis. We hypothesize that the stress kinases ERK, p38, and JNK play an important role in acinar cell cytokine production. Rat pancreatic fragments were incubated with 100 nM concentration of the cholecystokinin analog caerulein or 100 nM caerulein and specific ERK inhibitor (100 μM PD98059), specific p38 inhibitor (10 μM SB203580), or specific JNK inhibitor (20 μM SP600125). After 3 hours of caerulein treatment, pancreatic fragments were homogenized and assayed for total and phosphorylated ERK, p38, and JNK, and for tumor necrosis factor-α or interleukin-1β concentrations (ELISA). Pancreatic fragments stimulated with caerulein showed activation of ERK, p38, and JNK and increased cytokine concentrations (ANOVA, P<0.05). Specific stress kinase inhibitors significantly attenuated caerulein-induced activation of the corresponding stress kinase and cytokine production; however, the effect of the JNK inhibitor was comparatively less convincing. Increased activation of ERK, p38, and JNK in pancreatic fragments was not associated with significant increases in total ERK, total p38, or total JNK concentrations. The stress kinases ERK and p38 play an important role in caerulein-stimulated exocrine pancreatic overproduction of cytokines. The role of JNK needs further evaluation in this experimental model. This work was presented at the Forty-Seventh Annual Meeting of The Society for Surgery of the Alimentary Tract, Los Angeles, CA, May 22, 2006. Dr. Samuel was supported for this research by an American College of Surgeons Faculty Research Fellowship (2003–2005) and a National Institutes of Health NIDDK Career Development Award (grant K08-DK062805).     

重楼皂苷Ⅰ通过ERK/P65/DNMT1通路抑制前列腺癌PC3细胞生长的分子机制

目的:研究重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)对去势抵抗性人前列腺癌PC3细胞生长的抑制作用及其分子机制。方法:体外培养PC3细胞,予不同浓度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol/L)的PPⅠ处理24、48、72 h,另设对照组,MTT法观察PPⅠ对PC3细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹检测PPⅠ对磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、核转录因子kappa B(NF-κB)/p65以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)蛋白表达的影响,并加入ERK1/2抑制剂(PD98059)后检测PPⅠ对NF-κB/p65表达的影响。结果:MTT结果显示,PPⅠ能抑制PC3细胞的体外增殖,与对照组相比,PC3细胞从给药浓度0.4μmol/L(0.85±0.05 vs 1.00±0.00,P0.01)开始明显下降,且呈时间和剂量依赖性。流式细胞术检测显示,PPⅠ能明显诱导PC3细胞早期凋亡,与对照组相比,PC3细胞早期凋亡率从给药浓度0.8μmol/L(13.83±2.97 vs 4.83±0.95)开始明显增加(P均0.01),且呈剂量依赖性;Western印迹显示,PPⅠ以时间依赖性上调p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的激活与表达,与对照组相比,给药时间从2 h(1.73±0.17 vs 1.00±0.00,P0.01)开始,p-ERK1/2明显被激活表达,PPⅠ以剂量依赖性下调NF-κB/p65、DNMT1蛋白的表达,与对照组相比,给药浓度分别从1.6μmol/L(0.67±0.11 vs 1.00,P0.01)与1.2μmol/L(0.63±0.06 vs 1.00±0.00,P0.01)开始,NF-κB/p65、DNMT1表达明显下调;抑制ERK1/2磷酸化能逆转重楼皂苷Ⅰ对NF-κB/p65蛋白表达的下调,与PPⅠ组相比,PD98059+PPⅠ组NF-κB/p65蛋白表达(0.86±0.18 vs 0.43±0.09,P0.05)明显上调。结论:PPⅠ可能通过介导ERK1/2通路抑制NF-κB/p65和DNMT1蛋白表达,诱导PC3细胞早期凋亡,进而抑制细胞增殖。     

热损伤诱导的丝裂原活化蛋白激酶对活化蛋白-1的影响及其意义

目的 观察成纤维细胞热烫伤后丝裂原活化蛋白激酶以及活化蛋白-1的表达。方法 将培养的人成纤维细胞分成4组：(1)单纯热损伤刺激组；(2)热损伤刺激 碱性成纤维细胞生长因子处理组(10μg／L)；(3)预先加入PD98059(10μmoL/L)，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激；(4)预先加入PD98059 SB203580(各10μmol／L)阻断剂30min，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子刺激。伤后0、30、60和180min检测细胞外信号调节激酶(ERK)和原癌基因c-fos蛋白。结果单纯热刺激的成纤维细胞ERK表达增加，随后消失。碱性成纤维细胞生长因子刺激ERK表达增加显著，时间延长。加入PD98059拮抗剂，ERK的表达受抑制。原癌基因c-fos的表达开始增加，随后减弱。同时阻断ERK和p38MAPK两条通路，c-fos弱阳性表达。结论 碱性成纤维细胞生长因子引起热损伤成纤维细胞ERK表达增加，原癌基因c-fos是MAPK信号通路下游重要的靶蛋白。     

Erk和p38信号转导通路对大鼠肌源性干细胞内结缔组织生长因子表达的调控作用

目的 探讨肌源性干细胞(muscle derived stem cells,MDSC)受转化生长因子β1(transforming growth factor-1,TCF-β1)刺激产生结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的过程中,Erk信号转导通路和p38信号转导通路是否发挥作用.方法 采用细胞差速贴壁法,从新生大鼠骨骼肌中分离提取肌源性干细胞,进行细胞表型鉴定后传代培养.实验设空白组、对照组和实验组共8组:空白组,添加液为基础培养基;对照组,基础培养基中加TGF-β1;PD98059实验组,分别用20、40、80μM的PD98059预处理;SB203580实验组,分别用0.2、0.5、1.0μM的SB203580预处理.用Real Time-PCR和Western Blot分别检测细胞中CTGF mRNA和蛋白质的水平.方果 空白组、对照组和PD98059实验组间CTGF mRNA和蛋白质的相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05),对照组和SB203580实验组间差异均无统计学意义(P>0.05).方论 TGF-β1诱导NDSC产生CTCF的过程中,存在着Erk信号转导途径,不存在p38信号转导途径.     

缺氧时丝裂原激活蛋白激酶类对人肾小管上皮细胞富含半胱氨酸蛋白61基因转录活性的调控

目的 探讨丝裂原激活蛋白激酶类（MAPKs）对缺氧条件下人近端肾小管上皮细胞（HKC）中富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）基因转录活性的调控机制。方法 缺氧培养HKC，Northern印迹检测Cyr61mRNA表达；Western印迹检测Cyr61、p38、细胞外信号调节激酶（ERK1／2）、c—Jun—N末端蛋白激酶（JNK）以及缺氧诱导因子1c（HIF-1α）的表达。构建含有人Cyr61基因启动子的报告基因Cyr61-luc质粒，将其单独或者分别与表达活性MAPKs的质粒Ca—MEK1和Ca—MKK6共同瞬时转染HKC。通过荧光素酶活性检测观察缺氧、MAPKs抑制剂和MAPKs活性酶对Cyr61基因转录活性的调控。结果 缺氧时HKC表达cyr61、HIF-1α增高，ERK1／2、JNK、p38总量不变，而其各自的磷酸化形式均明显增加。HKC转染Cyr—luc后，p38通路抑制剂SB203580和ERK通路抑制剂PD98059显著抑制缺氧时Cyr61的转录活性，两者协同作用时抑制作用显著增强。Ca—MEK1与Cyr—luc共转染HKC后，Cyr61转录活性无改变；而Ca—MKK6与Cyr—luc共转染后，Cyr61转录活性显著增高。对缺氧培养的HKC，PD98059处理使HIF-1α和Cyr61蛋白表达显著降低；SB203580处理可显著降低Cyr61蛋白表达，但对HIF-1α无影响。结论 在HKC中，缺氧可通过p38通路直接上调Cyr61基因启动子活性，也可通过ERK1／2途径促进HIF-1α表达，间接调节Cyr61基因启动子活性。     

饰胶蛋白聚糖对大鼠肾系膜细胞生长的抑制作用及其信号转导途径的研究

目的 探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)对大鼠系膜细胞(MsC)生长的抑制作用及其信号转导分子MAPKs和p21表达的影响&#65377;方法 经脂质体介导将DCN基因转染体外培养的大鼠MsC,筛选和鉴定后,收集阳性细胞克隆的培养上清(DCN上清),将其加入正常MsC的培养液中, 采用流式细胞仪检测细胞周期&#65377;用Western 印迹法分别检测MAPKs,包括细胞外调节激酶(ERK)1/2&#65380;应激活化蛋白激酶(SAPK)/氨基末端激酶(JNK)和p38和p21蛋白表达;用免疫荧光法观察p21在细胞中的表达&#65377;结果 DCN上清明显抑制正常MsC的增殖, G2-M期细胞数明显减少,仅为对照组的35%(P < 0.05); 磷酸化ERK1/2及SAPK/JNK表达增强, 分别为对照组的2.2倍&#65380; 1.4倍及1.7倍&#65380; 1.8倍;磷酸化p38无明显变化&#65377;DCN抗体呈浓度依赖性抑制磷酸化ERK1/2&#65380; SAPK/JNK的表达上调&#65377;DCN上清还可使细胞p21的表达明显增强,而DCN抗体也同样呈浓度依赖性地抑制其上调表达的作用, ERK1/2 及SAPK/JNK通路抑制剂U0126和circumin均可抑制其上调表达的作用,分别为对照组的64%和61%;而p38通路抑制剂SB203580则对其无影响&#65377;结论 DCN对肾MsC的生长有抑制作用,其机制可能经ERK1/2&#65380;SAPK/JNK和p21蛋白介导&#65377;     

澳洲茄边碱对前列腺癌细胞增殖的抑制作用及机制研究

目的：研究澳洲茄边碱(solamargine,SM)对人前列腺癌激素非依赖细胞增殖的影响及可能的作用机制.方法用不同浓度 SM(0、1、2、4、6、8、10μmol/L)处理 DU145和 PC3细胞, MTT法检测 SM 对细胞生长的影响,Western blot 检测 SM 对相关信号通路蛋白 p38 MAPK、ERK1/2 MAPK、MUC1表达的影响.结果6μmol/L SM作用24 h后DU145和PC3细胞活力分别为(52.53±9.05)％、(56.28±2.36)％,并具有时间和剂量依赖;10μmol/L SM作用24 h后细胞活力分别为(27.36±2.72)％、(32.07±2.53)％.流式细胞术分析显示不同浓度 SM(0、4、6、8μmol/L)处理 PC3细胞能引起 PC3细胞阻滞在 G1期,G1期细胞比例分别为(52.61±0.50)％、(52.96±1.49)％、(66.16±2.84)％和(69.03±2.38)％.且能激活 MAPK信号通路减少下游蛋白 MUC1的表达.结论 SM能明显抑制DU145和PC3细胞生长,该作用可能与 MAPK信号通路的激活以及下游 MUC1蛋白表达下调有关.     

MKP-1/ERK通路参与雌二醇减轻中性粒细胞迁移的机制研究

目的研究雌二醇对f-MLP诱导的体外中性粒细胞活化的影响, 并探讨这种作用与ERK通路及其上游蛋白MKP-1的关系。方法将HL-60诱导分化成类中性粒细胞(dHL-60)。用MTT实验检测不同浓度梯度的E2、f-MLP、PD98059或混合液对dHL-60的影响。通过Transwell实验和超氧化物检测E2、PD98059对f-MLP诱导的dHL-60迁移和超氧化的抑制作用。Western blot检测ERK、p-ERK、MKP-1的表达水平。结果 E2、f-MLP、PD98059单独或联合使用对dHL-60细胞的存活率没有影响。f-MLP能显著诱导中性粒细胞迁移和过度氧化。生理、药理学剂量的E2和PD98059可以有效抑制f-MLP的这种作用。Western blot检测结果显示f-MLP诱导ERK磷酸化, 而E2和PD98059有效抑制f-MLP的这种作用。另外, 雌二醇能有效地增加MKP-1的表达。结论雌二醇可能通过增加MKP-1蛋白降低ERK磷酸化, 从而抑制f-MLP诱导的体外中性粒细胞迁移及超氧化。