必需氨基酸延缓秀丽隐杆线虫衰老的研究

利用模式生物秀丽隐杆线虫,考察8种人体必需氨基酸对衰老的影响。首先建立秀丽隐杆线虫寿命模型,以雷帕霉素为阳性对照药,分别考察8种必需氨基酸对线虫生存时间的影响。再用筛选出的氨基酸处理线虫21d,通过秀丽隐杆线虫-绿脓杆菌感染模型,考察氨基酸对线虫的抗感染能力的影响,利用实时荧光定量Real-Time RT-PCR方法检测氨基酸处理线虫后DAF-16/FOXO下游基因和免疫相关基因的表达水平。结果表明8种必需氨基酸中苏氨酸和异亮氨酸既能延长野生型线虫的寿命又能延长daf-16突变型线虫的寿命,同时还能增强秀丽隐杆线虫抗绿脓杆菌感染的能力,并提高免疫相关基因lys-7、clec-67的表达水平,而DAF-16/FOXO下游基因表达没有明显变化。因此苏氨酸和异亮氨酸能延长线虫寿命、提高抗感染能力,且对线虫寿命的延长作用不完全依赖于DAF-16/FOXO转录因子。     

基于模式生物秀丽隐杆线虫的三丁基锡生态毒性评价

本研究利用秀丽隐杆线虫半致死浓度分析和致死曲线分析来筛选对三丁基锡（Tributyltin,TBT）敏感的线虫品系,并讨论与TBT毒理学过程可能相关的基因。通过对秀丽隐杆线虫体长、每窝子代数和怀卵量的测定来探讨TBT的生态毒性效应,以期为TBT对秀丽隐杆线虫和人类的生态毒性评价和致毒机理研究提供科学依据。结果表明：TBT对各品系线虫48 h LC50从小到大依次为egl-1（n487）＜ced-4（n1162）＜cep-1（gk138）=cep-1（lg12501）＜ced-9（n1950）＜clk-2（mn159）＜ced-3（n717）＜N2＜opIs34（hus-1::GFP） ＜opIs56（egl-1::GFP）＜daf-16（mn86）＜hus-1（op241）＜daf-2（e1370）。本研究筛选出对TBT最敏感的线虫品系为egl-1（n487）,而对TBT耐受力最强的是daf-2（e1370）。TBT对秀丽隐杆线虫体长、每窝子代数和怀卵量均呈现浓度依赖型的抑制作用。     

以秀丽线虫为模式生物评价蓖麻碱毒性的研究

以秀丽线虫作为评价蓖麻碱毒性的模式生物,通过测定不同浓度的蓖麻碱提取物对线虫的半致死浓度、生殖能力和体内酶活性的影响,对蓖麻碱的毒性进行初步评价。结果表明,蓖麻碱提取物的48h的LD50为0.977mg/mL,72h的LD50为0.821mg/mL;随着蓖麻碱提取物浓度从0.5mg/mL增加到2.0mg/mL,虫体的SOD活性由(80.669±3.2)U/mg降低至(1.532±0.2)U/mg;CAT活性由(70.947±2.7)U/mg降低至(0.234±2.1)U/mg。说明蓖麻碱提取物浓度越大,毒性越强,线虫体内酶活越低,蓖麻碱提取物可使秀丽线虫生殖能力降低或丧失。     

秀丽隐杆线虫免疫衰老指标的建立

秀丽隐杆线虫是研究衰老的重要模式生物,但目前对其免疫衰老的研究缺乏评价指标。建立了秀丽隐杆线虫-铜绿假单胞菌感染模型,考察了线虫抗感染免疫能力与衰老之间的关系,建立了线虫免疫衰老的评价指标。首先用铜绿假单胞菌感染线虫建立模型,将处于不同衰老程度的线虫用于感染实验,考察了线虫感染后的生存时间与衰老程度的关系;将感染后的生存时间作为抗感染免疫衰老的指标,其结果与线虫抗氧化能力和寿命指标的结果相互印证。结果显示,7 d、14 d、21 d龄的线虫感染后的生存时间依次减少,与抗氧化能力的衰退情况相符;与野生型相比,长寿线虫(daf-2突变线虫)感染后的生存时间延长,短寿线虫(daf-16突变线虫)感染后的生存时间缩短,线虫的抗感染免疫指标与寿命指标结果相符;能延长线虫寿命的化合物酪氨酸也延长了线虫感染后的生存时间。因此线虫-铜绿假单胞菌感染模型可以用于评价线虫的免疫衰老,感染后线虫的生存时间可作为免疫衰老的评价指标。     

崇明拟异小杆线虫daf-16基因的功能鉴定

【目的】昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes,EPNs)的寿命和抗逆性是影响其商品化的重要因素。本研究旨在鉴定崇明拟异小杆线虫Heterorhabditidoides chongmingensis的模式品系DZ0503CMFT(DZ)的DAF-16基因的生物学功能,探讨该基因在DZ线虫的寿命和抗逆性中的作用。【方法】根据DZ线虫和其自身共生菌Serratia nematodiphila DZ0503SBS1~T(S1)及非自身共生菌S.nematodiphila DR186(186)共培养时生长发育的差异,结合已经构建的DZ线虫的数字基因表达谱(digital gene expression profile,DGE)文库,选取调控生长发育的胰岛素/类胰岛素信号通路(insulin/insulin-like growth factor signaling pathway,IIS)的主要转录输出信号DAF-16作为研究对象。通过同源性分析选取daf-16基因中特异性片段作为干扰片段,利用L4440质粒载体构建干扰片段的dsRNA表达载体,并转化到大肠杆菌Escherichia coli HT115(DE3)中。用饲喂法将daf-16dsRNA导入DZ线虫体内沉默基因;利用实时定量PCR检测RNA干扰效果,统计daf-16基因表达下调后的DZ线虫寿命、4个生理阶段的时长、抗逆性(热应激和氧化应激)以及表型(体长)和繁殖性状(48 h内产卵量、卵孵化率和雌虫率)等的变化。【结果】DZ线虫的daf-16 (GenBank登录号:MH101641) cDNA全长2 164 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)长1 353 bp,编码450个氨基酸。RNAi后DZ线虫体内的daf-16基因表达量被显著敲低,相对于对照组空载L4440降低了49.05%。RNAi组线虫平均寿命为14.96 d,比空载L4440组(17.60 d)降低了15.00%。DZ线虫daf-16 RNAi组在繁殖阶段和快速身体运动阶段的时长比空载L4440组的短,而快速咽吸阶段和咽抽吸阶段的时长比空载L4440组的长。处理7 d后DZ线虫daf-16 RNAi组在热应激(37℃)和氧化应激(10 mmol/L百草枯水溶液)处理时存活率显著低于DZ线虫的空载L4440组。在产卵量、孵化率、雌虫率和体长上daf-16 RNAi组与对照组之间没有显著差异。【结论】通过RNAi方法初步验证了DZ线虫的daf-16基因的生物学功能,该基因调控了崇明拟异小杆线虫的寿命和抗逆性。     

取代短链脂肪酸对秀丽隐杆线虫的抗氧化作用

短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是碳原子数为1～6的有机脂肪酸,不但可以作为生物体内能源物质,而且还具有抗炎、影响肠道菌群代谢和预防早发1型糖尿病等重要作用。然而,目前多数是对传统短链脂肪酸的生物学作用进行研究,对取代短链脂肪酸(short branched-chain fatty acids, SBCFAs)的相关研究甚少。本研究以秀丽隐杆线虫为模式动物,系统探究SBCFAs的抗氧化生物活性作用。采用胡桃醌氧化应激模型,在体内评价SBCFAs对秀丽隐杆线虫生存能力的影响,并通过体外抗氧化及H_2DCFDA荧光染色实验,进一步评价SBCFAs清除活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的能力。本研究证实,在氧化应激研究中,传统脂肪酸不能延长秀丽隐杆线虫的存活时间,而2′-甲基取代短链脂肪酸(n=4-6)具有显著的抗氧化作用。体外抗氧化实验表明,2′-甲基取代短链脂肪酸(n=4-6)不具有体外直接清除ROS的能力,但是H_2DCFDA荧光染色实验显示2′-甲基丁酸能够显著降低线虫体内的ROS水平,表明2′-甲基丁酸通过降低体内ROS水平,从而增强秀丽隐杆线虫的抗氧化应激能力。本研究提示,传统短链脂肪酸不具有抗氧化作用;2′-甲基取代短链脂肪酸(n=4-6)能显著增强秀丽隐杆线虫的抗氧化能力;甲基取代位置和取代烷基长度对短支链脂肪酸的抗氧化作用至关重要,其作用机制需进一步研究。     

野生蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫生理作用的影响研究

探索了不同浓度蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫整个生命周期生物学功能的影响,对蕨菜水提液的毒理性作出合理评价。实验以秀丽隐杆线虫为模式生物,通过给秀丽隐杆线虫喂食01 mL 6种不同浓度（00、02、04、06、08、10 g/mL）的蕨菜水提取液,观察不同浓度蕨菜水提取液对其生理指标（寿命、产卵数、运动性、细胞凋亡）的影响。研究结果表明：蕨菜能对秀丽隐杆线虫的生理指标产生较大影响,具体表现为随着蕨菜水提取液浓度增加,寿命逐渐缩短,产卵数逐渐减少,细胞凋亡数增加,三者均呈现出明显的浓度依赖性,而对运动性影响不大。     

西藏红景天提取物延长线虫寿命和抗氧化活性探索

探讨红景天苷和西藏红景天粗提物对延长线虫寿命的影响及其体外抗氧化活性的比较。以红景天苷、红景天粗提物为研究对象、以Vc为阳性对照,分别检测以上三种物质对自由基的清除作用。结果表明红景天能够显著延长秀丽隐杆线虫的寿命;在相同浓度下,红景天苷清除DPPH自由基的EC50约为1291.53μg/mL,红景天提取物溶液约为489.76μg/mL;红景天苷清除羟自由基的EC50约为1120.94μg/mL,红景天提取物约为1068.37μg/mL;红景天苷清除超氧阴离子自由基的EC50约为55.57μg/mL,红景天提取物溶液约为40.49μg/mL。中药红景天中含有显著延长线虫寿命的抗氧化物质,而这种成分并非是红景天苷。     

连翘花黄色素对线虫在氧化应激下的保护作用

自由基过度引起的氧化应激是多种疾病发生的因素。连翘花黄色素(forsythia flower yellow pigment, FFYP)中含有大量的抗氧化活性物质,但其对氧化应激的抵抗性仍不清楚。本文首先通过化学方法检测FFYP的体外抗氧化活性;用细胞内抗氧化活性（cellular antioxidant activity,CAA）方法检测FFYP细胞内抗氧化活性;然后以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C. elegans）为模型,检测FFYP对线虫氧化应激抵抗力及体内抗氧化指标的影响;用Daf 16和Skn 1突变体线虫和qRT PCR实验探究其作用机制。研究结果表明,FFYP具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力,铁离子还原能力和活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS）清除能力,并且具有浓度依赖性。用500 μmol/L的胡桃醌提供氧化应激压力时,FFYP能显著提高线虫在氧化应激下的寿命,表明FFYP可以提高线虫对氧化应激的抵抗力。进一步研究发现,FFYP可显著降低线虫体内ROS自由基含量,提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性,增加还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,表明FFYP通过提高线虫体内抗氧化防御系统活性清除自由基来提高线虫对氧化应激的抵抗力。突变体线虫实验显示,FFYP对线虫延长氧化应激下寿命的效应在Skn-1突变体线虫中完全消失,在Daf-16突变体中效应被减弱。qRT-PCR实验也显示,Daf-16和Skn-1靶基因的表达量均被提高。表明FFYP对线虫氧化应激抵抗力提高的作用是通过Daf-16和Skn-1共同作用。这预示着FFYP具有很好的抗氧化及抗应激药用价值,有潜力成为一种新的有生物活性的天然色素。     

秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于抗真菌药效评价的研究

目的观察秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于抗真菌药效评价的可靠性和稳定性,评价该模型在抗真菌药物研发中的应用价值。方法使线虫吞食白念珠菌造成致死性感染,建立线虫-白念珠菌感染模型,选用4种临床常见的抗真菌药物(氟康唑、两性霉素B、卡泊芬净和5-氟胞嘧啶)和白念珠菌群体感应分子法尼醇对感染后线虫进行治疗,观察线虫存活状态,记录生存率从而评价抗真菌药效。结果白念珠菌感染线虫后生成菌丝穿破线虫体表造成线虫死亡。氟康唑、卡泊芬净和5-氟胞嘧啶治疗后线虫体内白念珠菌菌丝生长呈现不同程度的抑制状态,线虫生存率有提高且存在量效关系。两性霉素B在该模型中也表现出了明显的体内抗真菌作用,但16μg/mL、32μg/mL的高浓度两性霉素B表现出毒性。法尼醇能够抑制线虫体内白念珠菌菌丝形成,但对线虫保护作用较弱。结论秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于体内抗真菌药效评价方法可靠,并具有通量高、成本低、周期短等优点,值得推广应用。     

秀丽隐杆线虫先天免疫信号转导途径

秀丽隐杆线虫因其结构简单、易于培养、生命周期短等特点作为一种模式生物已广泛应用于神经系统、衰老机制及细胞程序性死亡的研究。与高等生物不同,秀丽隐杆线虫缺少适应性免疫途径,只有先天免疫途径在抗病原菌、抗氧化应激等方面发挥重要的作用。其体内的胰岛素/胰岛素样生长因子(insulin/ IGF-1)、转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)和细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)4条免疫相关信号转导途径在不同的环境发挥着主要作用。同时,秀丽隐杆线虫的先天免疫系统在进化中有许多保守之处,这为高等生物的免疫机制研究提供了新思路。据此,就有关秀丽隐杆线虫先天免疫信号转导途径的研究进展进行了简述,期望能为人类等高等生物相关联的免疫作用研究提供借鉴和参考。     

rBTI及其突变体对C. elegans寿命的影响

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI）是一种来源于荞麦Potato Ⅰ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,rBTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,rBTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体,分别命名为rBTI-R45A,rBTI-R45F,rBTI-W53R和rBTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型rBTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0～10 μmol/L 范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10 μmol/L 野生型rBTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体rBTI-R45A,rBTI-R45F和rBTI W53R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型rBTI 可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种 rBTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,rBTI可增强长寿因子DAF 16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发rBTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI)是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0~10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

秀丽隐杆线虫体内脂滴的尼罗红染色观察

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为常见的生物实验模式之一,也是最近作为研究脂肪沉积的一种较理想的模型,其肠道是脂肪沉积的主要场所。本文使用尼罗红染液对秀丽隐杆线虫体内的脂肪进行染色,在荧光显微镜下可见其肠道周围呈现强烈桔黄色,较好的显示了线虫体内的脂肪沉积部位,为后续研究线虫脂肪沉积的调控机制奠定了基础。     

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）在药物筛选中的应用

基于靶点的体外药物筛选操作相对简单,成本较低,但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶点的作用程度,吸收、分布、代谢、排泄特征和毒性均会对早期先导物能否进入临床使用产生极大的影响,因此,药物的体内筛选受到重视。本文重点综述了秀丽隐杆线虫（C.elegans）在抗衰老、抗感染药物筛选中的应用情况。秀丽隐杆线虫结构简单、易于培养和可实现高通量筛选,在未来的药物筛选中必将发挥更重要的作用。     

不同浓度亳菊水提物对秀丽隐杆线虫脂滴凝聚影响观察

目的探讨毫菊对秀丽隐杆线虫脂肪沉积的影响。方法用不同浓度毫菊水提取液配制NGM培养基,培养同步化秀丽隐杆线虫,成虫经油红0染色,异丙醇萃取,测定OD值,并与普通NGM培养基培养的同步化线虫相比较。结果随着浓度的提高,线虫体内的脂肪沉积量呈现出一定的曲线变化,其具体机制有待于进一步研究。     

CdS/ZnS量子点对秀丽隐杆线虫的生物安全性研究

随着工农业的发展,各类材料如纳米材料、重金属材料应用,及其他一些生物质类材料的积累,对生物体的生长发育和繁殖等都有着较明显的生理毒理效应。只有对这些材料的生物效应有了清楚的了解才能正确地使用而避免它对人体产生毒副作用。本试验以秀丽隐杆线虫为研究对象,从生长发育到基因水平,考察了CdS/ZnS量子点对的生物安全性。研究发现CdS/ZnS量子点暴露不仅对秀丽隐杆线虫的体长、头部摆动以及身体弯曲等生物行为有不同程度的抑制作用,而且对线虫细胞毒性相关基因、胁迫相关基因以及细胞生长发育相关基因的表达也有一定的影响。当CdS/ZnS量子点的暴露浓度为3.33 nmol/L,线虫体长、头部摆动以及身体弯曲分别从空白组的(0.64±0.072)mm,(55.94±7.17)次/min和(9.95±2.42)次/20 s降到(0.48±0.099)mm,(15.83±6.76)次/min和(7.72±1.12)次/20 s;而GST-1,daf-21,HSP-16.4等基因表达分别增加了15.33, 19.51和35.01倍。本研究为量子点在应用过程中的生物安全性研究提供理论依据。     

秀丽隐杆线虫体内脂肪染色方法的探究

近几十年来,秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)因其结构简单、通体透明、生命周期短和易于培养,常作为一种模式生物被广泛用于现代发育生物学、遗传学、抗衰老和及脂肪调控等方面的研究。本文探索了一种对秀丽隐杆线虫体内脂肪的油红O染色方法,利用1%Triton X-100的透过作用,线虫体内脂滴可被油红O更好的着色,镜下观察颜色鲜红,染色效果较好,为以后研究线虫脂肪调控奠定了基础。     

铜对秀丽隐杆线虫毒性效应的研究

为了阐明铜(Cu)对秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans长期作用的毒性效应,对实验室多代筛选的耐铜型秀丽隐杆线虫进行了寿命、衰老、发育、生殖和运动等生物学指标的研究.结果显示耐铜型秀丽隐杆线虫与野生型秀丽隐杆线虫相比其寿命缩短、衰老提前、个体发育受到抑制,且出现繁殖率降低、生殖能力减弱、运动行为存在障碍等一系列生理变化.本文为理解与阐明Cu的毒性效应提供了实验资料,有助于深入开展Cu毒性机理的研究.     

羊栖菜多糖抑脂沉积及其机制研究

目的研究羊栖菜多糖(SFPS)对秀丽隐杆线虫脂肪沉积的影响,并探讨其机制。方法用不同浓度SFPS配制NGM培养同步化秀丽隐杆线虫,经油红O染色后,裂解虫体,在490nm波长处测定吸光度值,同时采用外翻肠囊法,考察不同浓度SFPS被大鼠小肠吸收的情况。结果在含不同浓度SFPS配制的NGM培养基上生长的线虫,当SFPS浓度越高,线虫吸光度值越小,与对照组相比差异显著。在低剂量浓度下(0.6mg/ml),大鼠小肠对羊栖菜多糖吸收不明显。结论SFPS可减少动物体内脂质含量,其机制可能与小肠的吸收有关。