在无血清培养基中代谢副产物对杂交瘤细胞生长代谢的影响:Ⅱ.氨的作用

目的 在无血清培养基中，研究氨对杂交瘤细胞生长代谢的影响。方法 在培养基中添加不同浓度的氨，考察细胞生长和代谢及单抗生成的变化。结果 添加0．8mmol/L）的氨时就对细胞生长和代谢有影响，当氨浓度达4mmol/L时，对细胞的生长代谢有明显的抑制，当培养基中氨浓度高于6mmol/L时，细胞生长停止，代谢受到严重影响。氨的添加降低了培养上清中的单抗浓度，但提高了单抗的比生产速率。结论 氨对细胞生长和代谢有较大的影响，对单抗浓度的影响主要由细胞密度降低造成，单抗的比生产速率增加。     

治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制

目的进行治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制研究。方法用细胞计数、ELISA和FCM分别检测细胞生长、抗体生成速度和抗原结合活性;冻存细胞复苏后及体外传代3个月,检测抗体分泌稳定性和克隆阳性率;进行无菌检查、细胞核型和同工酶谱分析,了解细胞遗传稳定性、外源因子污染和细胞间交叉污染情况。结果肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速度分别为0.047~0.052/h和1.1~1.4 pg/cell.h,与靶细胞FHCC98结合的阳性率达99%,平均荧光强度在200以上。冻存细胞复苏后及体外连续传代3个月后,其特异性抗体生成速度维持在1.0 pg/cell.h以上,培养上清抗体效价仍为1∶1 000。不同批次的生成细胞核型均符合杂交瘤细胞特征,外源因子检查阴性,无细胞间交叉污染。结论HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速率、抗体稳定性和特异性均符合已建立的规模化放大培养的种子细胞质控标准。     

抗rhTNFα杂交瘤细胞的体外培养及抗体分泌的研究

采用非CO2依赖培养基（CO2-IM）在无CO2、37℃条件下培养抗rhTNFα杂交瘤细胞，培养1周PH无显著变化，细胞生长趋势和抗体分泌显著超过DMEM。将CO2－IM与SFPF－HM混合后添加ITSE可以培养抗rhTNF杂交瘤细胞，其细胞生长速率、密度、活力和抗体产量均达到或超过含血清培养。     

无血清培养中杂交瘤细胞的能量代谢特性

在 10L生物反应器中 ,研究杂交瘤细胞C5 0在无血清培养条件下生长和能量代谢的特性。结果表明 ,细胞的比耗氧速率、ATP比生成速率和比生长速率有着相似的过程曲线 ,ATP比生成速率与比生长速率呈线性相关 ,反映了细胞能量代谢与生长之间的密切关系。同时发现 ,耗氧速率 (OUR)能够及时、敏感地反映细胞的代谢活力 ,预示细胞的生长变化。据此提出了利用OUR控制补料速率的初步设想。     

应用发酵罐生产单克隆抗体的初步研究

为了满足对单克隆抗体的需要,我们应用小型发酵罐对杂交瘤细胞进行了培养试验,并对可能影响细胞生长和抗体产生的因素作了初步探讨。同时还对降低血清含量对培养杂交瘤细胞的影响进行了试验。结果表明,3株细胞在发酵罐中生长良好。细胞最大密度达8×10~2/ml以上。培养上清中的抗体滴度接近静止培养水平,其中A_6和A_(11)>10~5,LS_(7.161)>1:64。接种细胞密度、培养时的pH、溶氧等对细胞生长有不同程度的影响。驯化的细胞在发酵罐中逐步降低血清量是可行的。     

牛布氏杆菌抗独特型杂交瘤细胞的悬浮培养研究

牛布氏杆菌抗独特型杂交瘤细胞F9株能稳定地分泌高效价的抗独特型抗体,其Ig类型为IgG2a,并具有抗原“内影象”和良好的免疫原性。该细胞培养在Techne－T104型1．5L细胞培养装置中,最适连续培养条件是pH7．1～7．5;36．5±0．5℃,搅拌速度35～45r／min。在连续悬浮培养时,细胞密度维持在3．2×105～8．2×105／ml,单克隆抗独特型抗体浓度可达1．04mg／ml,培养上清ELISA捕获法效价达1：160。     

表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化

在自主研发无蛋白培养基的基础上,考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的影响。结果表明,对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充,虽然不能促进细胞生长,但有利于培养后期细胞活性维持与抗体合成;B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间;作为重要的碳源和能源,葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长,而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成,维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间,从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基,CHO细胞在该培养基中的最高密度达到52.6×105cells mL 1,抗体产量达到274 mg L 1,与初始培养基相比分别提高了33%和63%。总之,在细胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分,以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。     

抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体制备方法的研究

目的研究抗氧化低密度脂蛋白(OxLDL)单克隆抗体的制备方法。方法采用小鼠体内法制备抗OxLDL单克隆抗体时,腹水中抗体经SuperoseTM6 HR10/30凝胶柱进行一步纯化;采用细胞培养法时,分别对杂交瘤细胞生长特性和抗体表达条件进行研究,细胞培养上清中抗体经Streamline SPXL阳离子扩张柱床层析和QXL阴离子交换层析纯化。结果小鼠体内法制备的抗体纯度为95.7%,回收率为65.4%;细胞培养上清中得到的抗体纯度为94.7%,回收率为47.8%。结论已建立了2种抗OxLDL单克隆抗体的制备方法,为OxLDL酶联免疫检测试剂盒的研制奠定了基础。     

体外培养杂交瘤细胞生产人用鼠源单克隆抗体

<正>目前,人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高（2～10mg/ml）,但由于所用的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用。由于体外法（杂交瘤细胞体外培养法）的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,     

人心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备人心肌脂肪酸结合蛋白(H-FAB)单克隆抗体。方法利用重组H-FABP蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)在PEG的作用下进行融合,通过杂交瘤细胞的筛选,细胞的亚克隆以及扩大培养建立分泌抗H-FABP特异性抗体的单克隆细胞株。将细胞接种入小鼠体内制备腹水抗体,纯化后得到抗H-FABP单克隆抗体并对其性质进行鉴定分析。得到3株稳定分泌H-FAB抗体的单克隆细胞株,命名为2C06、2F08、6G03,非竞争性ELISA测定亲和力常数得知三株抗体的亲和力常数都达到108以上,三株抗体的亲和力较好。交叉实验表明三株单克隆抗体与牛血清、猪血清、鼠血清均无交叉反应,western blot实验证明对H-FABP有较好的特异性。成功得到3株特异性识别H-FAB单克隆细胞株,可用于H-FAB的检测研究。     

一株有模拟CEA表位作用的抗独特型抗体

为了获得 CEA(癌胚抗原)表位内影象型抗体(抗独特型抗体 Ab_2 β),我们选用同系小鼠作为免疫动物,从而避免了用异种动物制备 Ab_2 时碰到的抗同种抗体和抗同种异型抗体对分析工作的干扰。抗 CEA 单克隆抗体(MAb)C50免疫同系 BALB/c 小鼠后,应用杂交瘤技术获得了2株 MAb,对其中一株 ID56进一步鉴定,发现 ID56仅与 C50有结合作用。不与另外2株抗 CEAMAb C6和 C14结合,ID56还能抑制 C50与 CEA 的结合反应,其腹水的竞争抑制效价为1∶64左右。ID56免疫同系小鼠产生了抗血清Ab_3 与 CEA 结合效价达1∶160,从而表明 MAb 56是 C50所识别的表位内影象。     

不同硫代修饰CpG ODN佐剂活性的比较

目的评价相同序列不同硫代修饰CpG ODN佐剂联合重组乙型肝炎疫苗表面抗原(rHBsAg)在BALB/c小鼠中的免疫原性,及在HEK-BlueTM hTLR9细胞上的活性。方法将4种(全硫代修饰的QCX1、部分硫代修饰的HS1和HS2及非硫代修饰的NS)CpG ODN及其阳性对照(全硫代修饰的CpG7909)按照相同配比分别与rHBsAg混合,使CpG ODN和rHBsAg终浓度均为20μg/mL,同时设等剂量抗原对照组(rHBsAg)及空白对照组(生理盐水)。分别肌肉免疫BALB/c小鼠,每只100μL,于免疫后1、2、4周摘眼球采血后处死小鼠,分离血清,应用化学发光微粒子免疫分析技术检测乙型肝炎病毒表面抗体(antibody to hepatitis B virus surface antigen,Anti-HBs)水平;取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,分离脾单个核细胞(mononuclear cell,MNCs),应用ELISPOT技术检测抗原特异性IFNγ、IL-2的分泌水平。体外应用HEK-BlueTM hTLR9细胞,检测4种CpG ODN及阳性对照CpG7909在该细胞上的活性,以及血清中放置不同时间后在该细胞上的活性。结果免疫后1、2、4周,各组小鼠血清Anti-HBs水平逐渐升高,其中免后2、4周,QCX1组小鼠血清抗体水平高于抗原对照、HS1、HS2、NS组;QCX1组小鼠MNCs在rHBsAg刺激下,分泌IFNγ和IL-2的能力显著高于HS1、HS2、NS和抗原对照组(P均<0.01);QCX1和HS2组刺激HEK-BlueTM hTLR9细胞活性的半数有效浓度(EC50)分别为5.94和6.52μg/mL,明显低于HS1(46.54μg/mL)和NS组(49.10μg/mL);随着不同硫代修饰CpG ODN在血清中放置时间的延长,仅全硫代修饰QCX1和CpG7909组细胞培养物A655基本不变,其他组均出现不同程度降低。结论全硫代修饰组QCX1佐剂增强小鼠细胞和体液免疫的能力与CpG7909相当,且在HEK-BlueTM hTLR9细胞上呈现较好的活性,在血清中也具有较好的稳定性。     

抗人A血型杂交瘤细胞高密度培养条件的研究

抗人 A 血型杂交瘤15B_4细胞在 CelliGen 细胞培养罐中进行连续灌注培养,细胞密度达1.6×10~7/ml。每天灌注新培养液量由1000ml 增到2300ml,第14天后又逐日减少至1000ml,死细胞数随着转速的增加和灌注量的减少而增多。血凝效价呈梯度上升,滴度达到2~(14),相当于腹水效价。培养6天 IgM 产量为0.2克/升/天,10～18天波动在1.45～1.8克/升/天。15B_4细胞代谢与葡萄糖、乳酸有关,与氨无关。CelliGen 自控效果较好,适用于杂交瘤细胞的高密度培养。搅拌速度在120～150r/min 对细胞产生的剪切力有明显地破坏作用。溶氧控制系统有待改进。     

高效价特异性HER2ME抗体的制备及鉴定

目的　制备高特异性HER2ME(Multi epitopeofhumanepidermisgrowthfactorreceptor 2 )抗体。方法将表达HER2ME基因的pcDNA3质粒与CpG混合免疫C5 7小鼠。结果　得到了HER2ME蛋白特异性抗血清。该血清与普通蛋白抗原免疫产生的血清相比 ,抗体特异性极高。未经纯化进行免疫印迹实验 ,显示出高度特异性。结论　表达质粒与CpG混合免疫可简单快速获得高特异性HER2ME抗体。     

The effect of specific growth rate and death rate on monoclonal antibody production in hybridoma chemostat cultures

Experimental data collected from bench-scale chemostat cultures of mouse-mouse hybridoma cells have been used for the development of a kinetic model of monoclonal antibody production. The specific antibody productivity was found to be proportional to the specific death rate, indicating a stimulating effect of stress on the ability of the cells to produce antibody. The death rate was found to be an exponential function of the average cell age in the culture. Furthermore, a Generalized Maintenance Energy (GME) model is proposed, to take account of the effects of culture stress on the nutrient uptake rates. The proposed relationships agreed very well with other mouse-mouse hybridoma chemostat culture data in the literature.     

Enhancement of monoclonal antibody productivity by promoting active hypothermic growth in hybridoma cells

BACKGROUND: Many reports have suggested that mild hypothermic culture conditions improve the specific monoclonal antibody (mAb) productivity of mammalian cells. The effect of active hypothermic growth on the mAb productivity of the hybridoma C₂E₇ was investigated. Hybridoma growth under hypothermic conditions (32 °C) was stimulated by supplementation of the culture medium with high serum concentrations (up to 30%). RESULTS: Specific and volumetric mAb productivity of a stimulated, active growth, mildly hypothermic hybridoma culture (30% FBS supplemented, 32 °C) were 1.38‐ and 1.34‐fold greater than the control culture (10% FBS supplemented, 37 °C). The enhanced specific mAb productivity under hypothermic conditions was associated with an increase in IgM mRNA levels during both the lag and early exponential phases of hypothermic growth. CONCLUSION: Stimulation of hybridoma growth under mildly hypothermic conditions increased both the specific and volumetric mAb productivity of hybridoma cells. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。