拟南芥中AtMEK5激活导致不依赖于水杨酸信号途径的细胞死亡

用MBP作为磷酸化底物的凝胶内激酶活性分析结果显示，在转基因拟南芥植株中诱导表达组成型激活的AtMEK₅蛋白（AtMEK₅^DD）引起的细胞死亡和用带有avr Rpt2基因的病原菌P. Syringe处理转基因植株导致的超敏性细胞死亡过程中，44kDa和48kDa的两个MAPK均被激活；AtMEK₅^DD在NahG转基因烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥杂交植株AtMEK₅^DD x NahG中诱导表达依然引起细胞死亡，且杂交植株中AtMEK₅^DD表达并未引起水杨酸含量的显著变化； Northern检测结果显示，病原菌处理可显著诱导AtMEK₅^DD转基因植株中PAL、PR1和PR5 基因的大量转录，而AtMEK₅^DD的表达仅导致PR5 基因的大量转录；表明有别于超敏性细胞死亡的水杨酸依赖特性，AtMEK₅激活引起的细胞死亡不依赖于水杨酸信号途径。     

转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达, 有效提高植物的抗逆性. 利用酵母单杂交技术从大豆(Glycine max)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因. 该基因编码174个氨基酸, 具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域, 其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E), 在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区. 利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体, 通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号, 获得103株T₀代再生植株, 通过PCR检测, 分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株. T₁代经过PCR, Southern blot, RT-PCR检测, 证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中, 并在转录水平上表达. 携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T₁代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明, 转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高, 说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.     

高赖氨酸含量基因在转基因小麦的表达

构建了含高赖氨酸含量基因(wblrp)和赖氨酸合成关键酶(dapA)基因的植物表达载体pBPC102, 用基因枪导入京花1号、京411、优899和烟农15等受体品种的幼穗和幼胚, 获得了100多株转基因小麦植株(T₀)及其后代株系(T₁~T₂). PCR和PCR-Southern杂交结果表明, 外源基因已稳定整合到转化植株T₀和T₁的基因组中. 进一步用RNA分子杂交的方法对高赖氨酸基因的表达及水平调控进行了深入研究, 结果表明外源基因已在T₂不同株系中获得了表达. 植株叶片游离赖氨酸(Lys)含量和种子结合态Lys含量的测定和分析结果表明, 有9个转基因植株后代株系叶片的游离Lys含量提高了2~3倍, 4个株系的Lys含量提高了10%以上, 小麦的营养品质得到了显著的改善.     

优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析

利用编码除草剂PPT抗性的bar基因作为选择标记, 构建了含有优质HMW谷蛋白亚基1Dx5和1Dy10基因的植物表达载体pBPC30, 用基因枪导入京花1号、京411号和京冬6号等受体品种的幼胚和幼穗, 获得了一批转基因小麦植株(T₀)及其后代株系(T₁～T₅). PCR, 点杂交和Southern杂交鉴定表明, 外源基因已整合到转化植株T₀的基因组, 并稳定表达. 转基因植株T₁代能抗20～80 mg/L的PPT, 其中1株抗性超过150 mg/L. 经SDS-PAGE分析表明, 外源1Dx5和1Dy10基因在T₂代不同株系中获得了表达. 转基因系TG3-74缺失了亚基8, 但亚基2, 5, 10和12都表达, 同时出现了一个新的亚基位于亚基7与原有亚基8之间(暂记为8^*). 品质分析结果表明, 有5个株系的Zeleny沉淀值为44.2～49.0 mL, 与对照CNN(48.0 mL)相当, 分别比京花1号(26.9 mL)和京冬6号(30.7 mL)提高了59.6% ~ 64.3%. T₅代株系的粉质曲线稳定时间比受体品种(3～7 min)大幅增长, 转基因株系TG5-23b的稳定时间为16 min, TG1-28d, TG3-76b, TG5-98和TG5-99的面团稳定时间高达30 min以上.     

表达Cryptogein基因的烟草抗病性和耐盐性增强

隐地蛋白(cryptogein, Crypt)是由隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)分泌的一种分子量约为10 kD的蛋白类激发子. 用农杆菌介导的叶盘转化法获转Crypt (PAL::Crypt)和CryK13V (CaMV35S::CryK13V)基因的烟草植株. 接种试验结果表明, T₂代转基因烟草株系对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotiana, Ppn)、赤星病菌(Alternaria alternata)和野火病菌(Pseudomonas syringae pv tabaci)的抗性显著增强. Northern杂交和RT-PCR分析结果表明, 低水平的表达转化基因Crypt和CryK13V就足以激活PR-1a和PR-5等防卫反应相关基因的表达; 在PAL::Crypt转化系统中, 病原菌Ppn能快速和高水平诱导PR-1a等病程相关基因的表达, 表明诱导型PAL启动子对入侵病原菌能及时识别并快速、有效地激活防卫反应, 从而赋予转基因植株抵抗病原菌侵染的能力. 研究还发现, 表达Crypt和CryK13V基因的烟草植株耐盐性比对照明显提高, 转化株系中高水平组成型表达PR基因和转录因子可能与耐盐性增强有一定正相关性. 上述结果表明, 植物对生物和非生物逆境的抗性途径和机制存在着交叉.     

红树植物耐盐基因转化烟草及耐盐品系的培育

从耐盐性强的红树植物白骨壤(Avicennia marina)中分离出的耐盐基因CSRG1, 构建了pGAM189/CSRG1转基因载体. 以烟草嫩叶为外植体, 通过农杆菌介导的叶盘转化法将CSRG1基因及GUS基因, Km^r基因和Hyg^r基因转入烟草基因组中. 转化50个外植体, 经过50 mg/L潮霉素和150 mg/L卡那霉素抗性筛选共获得了13个稳定抗性株系. 通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测, 结果表明, 最终获得的11个转基因品系(基因转化频率为22%)中, CSRG1基因整合到烟草的染色体DNA上. Northern blot分析结果表明, CSRG1基因在转基因植株中获得表达. 耐盐性测定和光合速率测定结果表明, 转基因植株在盐分提高到2% NaCl和全海水(盐度为24)配置的MS培养基中, 成活率保持在80%~90%, 株高增长20%~40%, CSRG1基因的表达产物及形成的生理代谢途径确实可使烟草获得较高的耐盐性, 同时这种耐盐性不仅针对钠离子胁迫, 而且对于各种离子的综合盐胁迫都具有耐受性.     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

大蒜金属硫蛋白家族新成员AsMT2b在镉离子胁迫下的功能分析

利用RACE方法, 从大蒜(Allium sativum)幼苗中克隆到一个MT基因家族的新成员, 命名为AsMT2b. AsMT2b全长520 bp, 编码80个氨基酸, 具有type 2 MT蛋白的结构特征, 但其Cys的位置和排列方式与其他type 2 MT蛋白具有明显差异. RT-PCR结果表明, 该基因与其他 type 2 MT的表达模式不同, 只有在CdCl₂的胁迫强度增加到一定程度时才增强表达. 将AsMT2b在酵母细胞中表达后可以提高转化子对Cd的抗性. 同时AsMT2b在拟南芥中过表达后, 转基因植株对Cd抗性显著增强, 同时Cd的积累量也增加. AsMT2b在镉离子胁迫下的特性表明, 其在Cd污染土壤的植物修复中具有应用前景.     

大丽轮枝菌毒素对棉花悬浮细胞NO和H2O2的产生和GST基因表达的影响

一氧化氮(NO)和过氧化氢(H₂O₂)是重要的信号分子, 参与调控植物的各种生理过程, 特别是在诱导植物防卫基因表达中有重要作用. 本文主要研究NO和H₂O₂是否参与棉花抗大丽轮枝菌毒素(VD-toxins)的抗性反应以及其对GST基因表达的调控作用. 结果表明, NO和H₂O₂信号参与棉花细胞抗大丽轮枝菌毒素的信号途径, 从而诱导抗性反应. NO和H₂O₂信号可能协同作用, 但不相互依赖. GST基因在棉花悬浮细胞抗大丽轮枝菌毒素抗性反应中起重要作用. NO对GST基因表达的调控不依赖H₂O₂, H₂O₂对GST基因表达的诱导作用更强.     

高粱C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分子克隆及其转基因水稻的培育

应用PCR的方法从C4植物高粱的基因组中分离出C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ppc基因). 通过分步克隆的方法, 将此基因插入pCAMBIA1301质粒载体上, 构成重组的表达载体p1301-PEPC, 并利用农杆菌介导的转化系统将其转入农垦58和中花10两个粳稻品种. 经PCR分析、PEPCase活性检测、Western杂交、Northern杂交和Southern杂交等多种方法鉴定表明, C4型Ppc基因已转化进受体水稻植株的核基因组, 并能高水平表达. 生理学检测显示, 转基因水稻植株的CO₂补偿点和光呼吸速率显著降低, 光饱和光合速率和羧化效率提高, 显示出C4植物的光合特征.     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

基因转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递

RNA干扰(RNAi)是引起生物体基因转录后沉默的新技术之一, 通过转基因向植物体内引入特异的RNA沉默信号, 已成功用于基因功能研究. 我们利用拟南芥动蛋白异型体KatB和KatC两个基因上共有的一段同源编码序列(168 bp)构建了能导致目标基因KatB和KatC双基因转录后沉默的DEX (dexamethazone) 诱导性RNAi载体. RT-PCR和Northern blot结果显示, 转基因拟南芥纯合体植株(简称RNAi型植株)经DEX诱导后,KatB和KatC的mRNA逐渐减少, 表明这两个基因发生了转录后沉默作用. 用改进后的简易方法将RNAi型与野生型拟南芥植株进行高效率嫁接, 对砧木和接穗中目标基因mRNA变化进行了半定量RT-PCR检测. 结果表明, 无论用RNAi型植株作为砧木或接穗, DEX诱导产生的基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中KatB和KatC mRNA的减少, 证明说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递; 与已报道的基因沉默信号在烟草嫁接体内传递速度相比, 拟南芥基因沉默信号的传递更为迅速．     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

新型钒氧吡唑配合物的合成与表征

在室温条件下, 用相同的原料合成了两种新的以简单吡唑(C₃H₄N₂简写为pz)为配体的不同钒氧配合物, VO(pz) ₄ (SO₄)·H₂O (1)和V₂O₂ (m-pz) (m-OOSO₂)(m-OCH₃)(pz) ₄ (2). 配合物1是单核的以4个吡唑为端配的钒氧配合物; 配合物2是以吡唑阴离子、硫酸根和甲氧基为桥基的三元异桥双核配合物. 对两个配合物进行了元素分析、红外光谱表征, 并用X单晶衍射测定了配合物1和2的晶体结构. 此外, 进行了非等温热分解动力学研究. 配合物1的晶体属于正交晶系, 空间群: Pna2₁, a = 14.547(2) Å, b =10.895 (2) Å, c =11.835 (2) Å; a = b = g = 90°, V = 1875.8(5) ų, Z = 4, R₁ = 0.0485, wR₂ = 0.1092. 对于配合物2: 三斜晶系, 空间群: Pī, a =8.377(2) Å, b =9.928(2) Å, c = 16.527(3) Å, a = 85.54(3)°, b = 80.92(3)°, g = 87.92(3), V =1352.7(5) Å₃, Z = 2, R₁ = 0.1461, wR₂ = 0.4444. 非等温热分解动力学研究表明, 配合物1的第一阶段和第二阶段热分解反应可能的反应机理分别为成核与生长n = 1/3, 三维扩散n = 2. 配合物2第一阶段和第二阶段热分解反应可能的机理分别为化学反应, 三维扩散n = 2.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.