纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞作为软骨组织工程支架的可行性及有效性,并为后续研究可注射性材料做基础。方法：体外分离培养软骨细胞后接种到纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料体外培养4周,然后植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察。并进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果。结果：大体观察4周后,实验组软骨缺损区可有乳白色组织修复,12周可修复完全,并无明显凹凸感。光镜下8周可见大量软骨细胞修复,并在TB染色下见Ⅱ型胶原比4周时明显增多。12周时软骨陷窝结构形成,细胞形态排列及Ⅱ型胶原与正常软骨组织相近。结论：纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。并为构建可注射性修复材料提供途径。     

软骨细胞体外培养支架材料研究进展

软骨组织损伤后自身修复能力有限,组织工程构建对软骨缺损的修复意义重大,为功能软骨的修复提供了新希望,而软骨细胞体外培养支架的研究是重要一环.运用于骨组织工程的人工合成支架材料来源广、可批量生产、可控降解速度,力学强度好、易于塑形;天然支架材料亲水性强,细胞粘附性、生物相容性好;人工合成材料复合天然材料取各自所长,克服各自缺陷,支架性能提高.通过对材料表面进行修饰,可改善细胞与支架材料的相互作用.通过模拟细胞生长微环境,制备仿生材料,可提高材料的亲水性、对细胞的粘附性,促进细胞的分化增殖.纳米材料的出现为细胞体外培养支架的研究提供了新选择.该文就软骨细胞体外培养支架材料近年的一些新进展作一综述,并预测今后研究的主要方向.     

体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验研究

[目的]探讨软骨组织工程方法修复骨软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。[方法]体外诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞定向分化，分别与PLGA支架复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬关节骨软骨缺损深层置入MSC-支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC-支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。[结果]16周实验组缺损区完全由透明软骨修复，与周围正常软骨完全融合，组织观察显示以软骨细胞修复为主，软骨下骨形成，潮线基本恢复；阴性对照组缺损区主要由纤维组织修复，部分由透明软骨修复，组织观察显示以纤维细胞修复为主，混有部分软骨细胞；空白对照组完全由纤维组织修复。[结论]MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCs-PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。     

胶原/羟基磷灰石支架负载软骨细胞修复兔膝关节骨软骨缺损

目的 探讨胶原复合梯度羟基磷灰石(Col/HA)双相支架负载软骨细胞修复兔膝关节骨软骨缺损的可行性及疗效.方法 构建Col/HA双相支架,将软骨细胞种植于支架培养1周,再将软骨细胞-支架复合体移植修复兔膝关节股骨髁的骨软骨缺损,并对骨软骨缺损的修复进行检测.结果 光镜及扫描电镜观察显示软骨细胞在Col/HA支架中贴附良好,表型维持稳定,分泌胞外基质.大体观察和组织学检测显示,植入体内16周后实验组软骨层呈透明软骨样修复,软骨下骨缺损有新骨构建;对照组骨软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维性组织或纤维软骨组织形成.Wakitani评分显示实验组修复组织优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 双相Col/HA复合支架可作为骨软骨组织工程支架,负载软骨细胞可修复兔膝关节骨软骨缺损,重建关节软骨的结构和功能.     

组织工程软骨支架材料的研究进展

近年来，采用组织工程学方法构建软骨复合组织成为软骨修复方面新的研究领域。在组织工程中，种子细胞、可降解的支架材料以及细胞生长调节因子并称为组织工程的三大基本要素，其中支架材料在软骨修复过程中所起的作用至关重要。组织工程软骨支架材料的目的是为构建软骨细胞提供三维空间结构，有利于细胞的黏附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境。     

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点. 方法将3周龄幼兔第1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合,接种于聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸(CPPF/PLLA)三维支架材料,构建组织工程软骨组织块,连续培养4周.行大体、倒置显微镜及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组织化学光镜观察,定量检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量. 结果构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形,种子细胞呈稳定的三维均相分布,外观逐渐呈乳白色、半透明,硬度亦不断增加.培养1周有软骨细胞陷窝形成,2周后形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨,且Ⅰ型胶原逐渐转为阴性.4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似,硫酸GAG含量平均为天然骺板软骨的34%以上. 结论骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构,能满足修复骺板缺损的基本要求.体外培养1～2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机.     

胶原凝胶包埋软骨细胞复合聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸支架异体移植修复兔关节软骨缺损

目的探讨胶原凝胶包埋软骨细胞复合聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸(CPPf／PLLA)支架异体移植修复兔关节软骨缺损的有效性和可行性。方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种CPPf/PLLA支架构建的复合物体外培养3周，行倒置显微镜和扫描电镜观察，并将复合物异体移植入兔关节软骨缺损，术后4、8、12周取材，从大体、组织学和Ⅱ型胶原免疫组织化学对再生软骨组织进行评价。结果复合物体外培养3周，细胞被大量基质包裹，在支架内分布均匀；新形成的组织为透明软骨样组织、表面光滑且与周围组织整合良好、基质内有Ⅱ型胶原分布。结论胶原凝胶包埋软骨细胞接种CPPf／PLLA支架的方法能提高细胞一支架复合物构建质量，胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架可作为软骨细胞载体修复关节软骨缺损。     

天然生物支架材料在软骨修复中的研究进展

关节软骨缺乏再生能力，外伤或疾病引起的软骨缺损需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，但可引起免疫排斥反应，而导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chertman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。1977年，Green等以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是作者第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复。当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成支架材料无可比拟的优势。本文就天然生物支架材料在软骨修复中的现状和研究进展做如下综述。     

微载体/水凝胶复合支架修复大鼠膝关节骨软骨缺损

[目的]探索以负载软骨细胞的Cytodex-3微载体和藻酸钠水凝胶为材料,制备微载体/水凝胶复合支架,并观察以此修复大鼠膝关节骨软骨缺损的效果。[方法]将大鼠软骨细胞与Cytodex-3微载体置于旋转式三维生物反应器(rotary cell culture systems,RCCS)中,软骨细胞在微载体表面快速大量扩增后,将负载有软骨细胞的微载体均匀的与藻酸钠水凝胶混合,制备微载体/水凝胶复合支架,并以此修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损。实验分3组,A组:负载有软骨细胞的Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;B组:单纯Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;C组:空白对照组。术后6、12周取材,据大体、组织学、Micro-CT等检测结果对骨软骨修复效果进行评估。[结果]大体观显示A组的软骨修复效果明显优于B组和C组。组织学分析示A组的修复组织主要以透明软骨为主,而B组和C组主要以纤维组织为主。Micro-CT扫描结果表明各种软骨下骨均得到不同程度的重建,A组效果优于其他两组,比较差异有统计学意义。[结论]负载软骨细胞的微载体/藻酸钠水凝胶复合支架能够高效的修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损,这种将微载体与水凝胶结合构建复合支架的方法,为组织工程软骨的制备提供了新的途径。     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。     

Feasibility of Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell–Derived Extracellular Matrix Scaffold for Cartilage Tissue Engineering

Extracellular matrix (ECM) materials are widely used in cartilage tissue engineering. However, the current ECM materials are unsatisfactory for clinical practice as most of them are derived from allogenous or xenogenous tissue. This study was designed to develop a novel autologous ECM scaffold for cartilage tissue engineering. The autologous bone marrow mesenchymal stem cell–derived ECM (aBMSC‐dECM) membrane was collected and fabricated into a three‐dimensional porous scaffold via cross‐linking and freeze‐drying techniques. Articular chondrocytes were seeded into the aBMSC‐dECM scaffold and atelocollagen scaffold, respectively. An in vitro culture and an in vivo implantation in nude mice model were performed to evaluate the influence on engineered cartilage. The current results showed that the aBMSC‐dECM scaffold had a good microstructure and biocompatibility. After 4 weeks in vitro culture, the engineered cartilage in the aBMSC‐dECM scaffold group formed thicker cartilage tissue with more homogeneous structure and higher expressions of cartilaginous gene and protein compared with the atelocollagen scaffold group. Furthermore, the engineered cartilage based on the aBMSC‐dECM scaffold showed better cartilage formation in terms of volume and homogeneity, cartilage matrix content, and compressive modulus after 3 weeks in vivo implantation. These results indicated that the aBMSC‐dECM scaffold could be a successful novel candidate scaffold for cartilage tissue engineering.     

人组织工程软骨的实验研究

目的　了解组织工程研究的基本原理 ,完善制作组织工程化人软骨的技术方法 ,探讨天然可吸收材料组织 ,引导再生胶原膜作为人软骨细胞体外培养支架的可行性 ,为广泛开展组织工程的研究与应用开辟新的途径。方法　利用组织工程技术制作人组织工程化软骨 ,并应用组织学方法 ,对获得的人组织工程化组织形态和功能进行表征。结果　培养的软骨细胞均匀沉降于医用组织引导再生胶原膜上 ,1周后形成一层乳白色软骨样组织 ;植入 8周后从裸鼠体内获得软骨样组织 ,组织学检测证实软骨细胞的存在 ,软骨细胞可以分泌硫酸软骨素。结论　医用组织引导再生胶原膜以其特有的三维结构和细胞网结功能 ,可以作为组织工程技术应用研究中软骨细胞培养的支架 ;利用组织工程技术 ,能够完成人组织工程化软骨的制作。     

壳聚糖在喉软骨组织工程中的应用

喉癌、喉狭窄、外伤等引起的喉软骨缺损是耳鼻咽喉科常见的损伤,喉软骨的修复重建是临床面临的重大挑战。软骨因无血管和淋巴,自身修复及再生能力差,目前尚未能重建出持久的喉软骨组织来替代受损的喉软骨。组织工程的兴起给喉软骨重建带来新的契机,其关键在于设计合适的支架材料以负载种子细胞和生长因子,促进喉软骨再生,以实现喉软骨修复重建。壳聚糖材料具有良好的生物相容性,可诱导软骨细胞附着、增殖,易于塑形,生物降解速率可调控,已广泛应用于组织工程研究。本文总结了喉软骨的结构特点、壳聚糖的特性,以及壳聚糖在软骨组织工程中的应用,以探索壳聚糖在喉软骨组织工程中应用的可能性。     

Tissue engineering of osteochondral constructs in vitro using bioreactors

Articular cartilage is a relatively simple tissue, but has a limited capacity of restoration. Tissue engineering is a promising field that seeks to accomplish the in vitro generation of complex, functional, 3-dimensional tissues. Various cell types and scaffolds have been tested for these purposes. The results of tissue engineered cartilage and bone are as yet inferior to native tissue. Strain and perfusion have been shown to stimulate cell proliferation and differentiation of various cell phenotypes. The perfect protocol to produce articular cartilage has not been defined yet. Bioreactors could provide the environment to engineer osteochondral constructs in vitro and to provide a stress protocol. The bioreactor has to provide an economically viable approach to automated manufacture of functional grafts under clinical aspects. Composite engineered tissues, like an engineered joint, represent a future goal. Cross-disciplinary approaches are necessary in order to succeed in engineering osteochondral grafts that provide adequate primary biomechanical stability and incorporate rapidly in vivo with histological appearance close to healthy osteochondral tissue. This review surveys current clinical and experimental concepts and discusses challenges and future expectations in this advancing field of regenerative medicine focusing human osteochondral constructs in bioreactors.     

Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering

Tissue engineering has become a promising strategy for repairing damaged cartilage and bone tissue. Among the scaffolds for tissue-engineering applications, injectable hydrogels have demonstrated great potential for use as three-dimensional cell culture scaffolds in cartilage and bone tissue engineering, owing to their high water content, similarity to the natural extracellular matrix(ECM), porous framework for cell transplantation and proliferation, minimal invasive properties, and ability to match irregular defects. In this review, we describe the selection of appropriate biomaterials and fabrication methods to prepare novel injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. In addition, the biology of cartilage and the bony ECM is also summarized. Finally, future perspectives for injectable hydrogels in cartilage and bone tissue engineering are discussed.     

自体骨髓间质干细胞外基质支架在体外软骨组织工程中的应用

 目的 探讨利用自体骨髓间质干细胞外基质(autologous bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular matrix,aBMSC-dECM)支架体外制备组织工程软骨的可行性。方法 取2周龄新西兰大白兔5只,分离、培养骨髓间质干细胞,原代培养4周,收集其分泌的细胞外基质,制备aBMSC-dECM支架。对支架行扫描电镜和HE染色观察。分离培养自体软骨细胞,植入支架内,48 h后对细胞-支架复合物行Live-Dead染色。分别于种植后1、2、4和6周对细胞-支架复合物(组织工程软骨)进行大体观察、体积测量、HE染色、Safranin-O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、Real-Time PCR检测和抗压强度测试。对照为atelocollagen支架。结果 aBMSC-dECM支架呈三维多孔状海绵样结构,孔隙分布均匀,连通性较好,孔径(304.4±108.2) ?滋m,孔隙率93.3%±4.5%。与atelocollagen支架组比较,aBMSC-dECM支架组组织工程软骨呈乳白色,表面光滑有弹性,随观察时间延长体积逐渐增大,软骨细胞数量、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原含量逐渐增多,Ⅱ型胶原及Aggrecan的mRNA持续高表达,抗压强度持续增高。结论 aBMSC-dECM支架有利于维持软骨细胞活性和生物学功能,促进组织工程软骨形成。     

Tissue engineering with chondrocytes

Tissue engineering of cartilage, using chondrocytes based on the use of synthetic biodegradable polymer cell delivery vehicles (scaffolds), is an alternate treatment modality for replacing missing cartilage. Cartilage tissue engineering has an important role to play in the generation of graft material for head and neck reconstruction. It is an approach to fabricate cartilage constructs in vitro, which could be used in reconstructive surgery. Methods involve (1) harvesting septal cartilage during septoplasty, (2) isolating chondrocytes through enzymatic digestion of the septal cartilage, (3) expanding the cell number in a two-dimensional monolayer culture, using serum-free media, (4) seeding the cells onto a biodegradable polymer scaffold, and (5) cultivating the seeded scaffolds in a rotating bioreactor. In this article we briefly outline the methodology and clinical applications of cartilage grown ex vivo.     

大鼠脂肪干细胞复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架构建组织工程软骨

目的 探讨大鼠脂肪干细胞复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架的优越性.方法 选用6周龄健康Wistar大鼠,分离出脂肪干细胞后行体外培养.将Ⅰ型胶原溶液与壳聚糖溶液混合后冷冻干燥,交联硫酸软骨素后再冷冻干燥得到复合三维支架,检测支架的孔径值、含水量及孔隙率.将接种的脂肪干细胞消化后分别接种到平面、微球和支架,软骨方向诱导培养.MTT检测细胞增殖情况,3周后倒置显微镜及扫描电镜观察细胞形态及在支架上的生长及黏附情况,并分析成软骨分化的情况.结果 5 d后MTT检测显示三维支架组及微球组细胞增殖速度较平面组快;三维支架组14 d后仍有细胞增殖.组织学分析显示细胞在支架上密集重叠生长,内层仍有残留支架结构.Ⅱ型胶原免疫组化检测结果显示,三维支架组及微球组表达呈强阳性,而平面组表达呈弱阳性.RT-PCR结果显示各组均有软骨特异性mRNA的表达.但平面组一直表达X型胶原,微球组培养至21 d时也表达X型胶原,而三维支架组则一直未表达.结论 复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架能促进细胞的增殖、分化,并能更好地维持软骨细胞的表型,可以作为组织工程构建软骨的最佳选择.     

血管组织工程的进展

血管组织工程就是在体外构建理想的血管移植物。在过去20余年中涌现出了许多制备血管替代物的方法，包括胶原胶、脱细胞、细胞接种可降解材料等技术，这些成果显示了组织工程血管在临床应用方面的巨大潜力。目前，血管组织工程面临的挑战在于机械性能和抗血栓性，该领域今后的发展方向为细胞来源、体外培养环境、细胞增殖、黏附性和支架材料等。     

壳聚糖在软骨组织工程中的应用

目的 对高分子生物材料壳聚糖在软骨组织工程中的应用现状进行综述。方法 广泛查阅近年来有关壳聚糖在组织工程中应用的文献，综合分析，讨论 其生物相容性、可降解性及其应用。结果 壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，除能提供细胞生长所需的三维支架作用外，还能提供类似软骨基质的细胞外环境，维持细胞表型及功能。结论壳聚糖在软骨组织工程中具有良好的应用前景。