人眼眶脂肪基质细胞的分离培养、鉴定及成脂诱导分化的研究

目的 探讨人眼眶脂肪基质细胞(hOADSC)体外分离培养、鉴定方法及其向脂肪细胞诱导分化的能力。方法 采用组织块培养法分离人眼眶脂肪基质细胞并在体外进行原代培养及传代扩增。取第二代hOADSC细胞, 用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD31、CD44、CD45的表达情况;采用成脂诱导培养液体外诱导hOADSC细胞向成熟脂肪细胞分化并用油红O染色。倒置相差显微镜下观察hOADSC形态、测定细胞贴壁率、细胞倍增时间、CCK-8检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线。结果 组织块培养法分离得到hOADSC, 细胞呈梭形或纺锤形生长, 传代后细胞增殖迅速。细胞表面标志物CD29、CD31、CD44、CD45的表达率分别为99.0%、1.5%、99.1%、1.2%。hOADSC在体外成脂诱导培养液的作用下可分化为成熟的脂肪细胞, 细胞内的脂肪滴被油红O染为红色。传代培养hOADSC细胞贴壁率为92.6%, 细胞倍增时间为1.98 d, 细胞可在体外生长传代扩增10余代。结论 采用组织块培养法成功地分离培养了hOADSC, 其在体外成脂诱导培养液的作用下可分化为成熟的脂肪细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与初步鉴定

目的探讨体外分离、传代培养大鼠骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的方法,并对培养细胞进行初步鉴定,为利用大鼠骨髓MSCs进行感音神经性聋细胞移植治疗的研究奠定基础。方法用贴壁培养法分离大鼠骨髓细胞,第1组于24小时全量换液,第2组于24小时半量换液,第3组于3天全量换液,传代扩增。相差显微镜进行形态学观察;RT—PCR检测培养细胞表面分子表达;定向诱导培养细胞向成脂细胞、成骨细胞方向分化。结果24小时首次全量换液组培养7天后观察见少量细胞集落,细胞形态不规则;24小时首次半量换液组培养7天后观察见较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形;3天首次全量换液组培养7天后观察见较多悬浮细胞．与贴壁细胞混杂在一起。培养细胞表面分子SH2、CD31、CD44呈阳性表达,但不表达CD34。第2组培养细胞传代后加入不同诱导剂定向诱导分化一定阶段,分别经油红O及VOFIKossa法染色鉴定证实MSCs可分别向脂肪细胞及成骨方向分化。结论本实验分离培养的大鼠骨髓原代细胞24小时首次半量换液培养利于大鼠骨髓MSCs的分离和纯化,可稳定表达SH2、CD31、CD44。MSCs具有多项分化潜能。     

大鼠听泡原代成骨细胞分离培养及鉴定

目的 对SD大鼠听泡的原代成骨细胞进行分离培养及鉴定。方法 选取6只出生24 h的SD乳鼠，从颞区无菌分离出听泡组织，经0.25%胰蛋白酶和I型胶原酶消化后接种培养；待生长融合至80%密度时，进行传代培养，于倒置显微镜下观察原代及传代成骨细胞的生长状态，并用EDU法分析其增殖趋势。对生长良好的细胞进行成骨诱导分化，并用ALP试剂盒和茜素红试剂盒进行染色分析，鉴定分化效果。结果 大鼠听泡原代及传代成骨细胞培养中，细胞均贴壁良好、生长旺盛，第2 d分别可融合生长至50%、30%的密度，第4 d分别可融合生长至80%、70%的密度，形态呈现多样化。EDU法检测分析见：第1～4 d细胞增殖比均维持在较高水平，从第5 d起呈直线下降趋势。经诱导分化后，细胞生长状态良好，形态依旧多样化，早期以梭形为主，中后期形态较为丰腴。分化后2周，ALP染色见大量细胞胞质呈现深蓝色；第15 d经茜素红染色便可见局部出现橙红色钙化结节。结论 通过胰酶联合胶原酶两步消化法，成功地从SD乳鼠听泡中分离出原代成骨细胞，所得细胞生长及传代能力强，经诱导分化后具备良好的成骨活性，为鼓室硬化等疾病的体外研究提供可能。     

罗格列酮对Hep-2细胞增殖的影响及机制研究

目的:探讨罗格列酮(ROS)对体外培养的人喉癌Hep-2细胞的增殖抑制作用及其机制。方法:应用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度ROS处理不同时间喉癌Hep-2细胞后细胞的增殖活性,制作生长抑制曲线。采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化。RT-PCR检测环氧化酶(COX-2)mRNA表达的变化。结果:ROS明显抑制人喉癌Hep-2的增殖,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测发现:ROS阻滞Hep-2细胞于G0/G1期,并呈典型的凋亡特征性的亚G1峰,S期和G2/M期比例下降,其凋亡率呈时间依赖性上升(P<0.05)。RT-PCR检测发现人喉癌Hep-2细胞COX-2mRNA表达显著下降(P<0.01)。结论:ROS对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,其作用机制与阻滞细胞于G0/G1期和下调COX-2表达有关。     

人喉癌细胞异质性亚群的克隆分离及性质初探

目的通过原代培养人喉癌细胞、克隆分离异质性细胞亚群,初步探讨喉癌异质性机制。方法原代培养人喉癌细胞,采用有限稀释法单细胞体外培养喉癌细胞,比较克隆分离得到的异质性亚群在功能状态、细胞周期、形态、在无血清干细胞培养基中生长情况及裸鼠异体移植成瘤能力等方面的差异。结果分离得到Ⅰ型和Ⅱ型两个具有明显形态差异的细胞亚群。Ⅰ型细胞呈多角形,突起多,裸鼠移植可成瘤(4/5);而Ⅱ型细胞呈长梭形,突起较少,裸鼠异体移植不成瘤(0/5)。Ⅰ型与Ⅱ型细胞相比,RNA含量低,体外增殖能力强,能在无血清干细胞培养基中聚集呈肿瘤细胞球状生长;Ⅰ型细胞处于细胞周期G0/G1的比例明显高于Ⅱ型细胞。对Ⅰ型细胞亚克隆培养,产生的子代克隆集落出现了异质性的细胞,而Ⅱ型细胞亚克隆培养未能产生子代细胞。结论原发性喉癌细胞中存在着异质性的肿瘤细胞亚群,Ⅰ型细胞具备肿瘤干细胞的特性。     

喉癌干细胞在放化疗抵抗中的作用机制

目的：探讨喉癌干细胞的分选方法,分析顺铂、放射线联合应用对喉癌肿瘤干细胞的杀伤效应及机制。方法：应用流式细胞仪荧光活化细胞分选技术检测并分选出喉癌Hep-2细胞系中的CD133＋细胞和CD133-细胞,并检测CD133＋细胞亚群的干细胞特性;采用CCK-8试剂盒分别检测顺铂、放射线对两组细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测不同干预方案对2组细胞凋亡率及细胞周期分布情况的影响。结果：CD133＋细胞在喉癌Hep-2细胞系中占（2．43±0．77）％,在细胞增殖、分化及体内成瘤试验中CD133＋细胞均表现出肿瘤干细胞特性;不同浓度剂量的顺铂、放射线对Hep-2细胞均有抑制作用,并在一定浓度范围内呈剂量依赖性;顺铂、放射线单独或联合应用时,CD133-细胞凋亡率显著高于CD133＋细胞（P〈0．01）,并产生G0／G1期阻滞。结论：CD133＋细胞较CD133-细胞更具有明显的肿瘤干细胞特性,对放化疗具有明显的抵抗作用,对凋亡诱导作用不敏感和细胞周期改变为其机制之一。     

新生小鼠膜迷路耳蜗外侧壁的组织培养

目的培养小鼠耳蜗螺旋韧带/血管纹来源的细胞,为体外研究提供细胞模型。方法显微解剖新生小鼠耳蜗螺旋韧带/血管纹组织,组织块外植培养,胰蛋白酶消化分离细胞,免疫组织化学染色,原位透射电镜观察鉴别细胞的来源。结果自外植耳蜗螺旋韧带/血管纹组织生长出上皮样细胞及成纤维样细胞。前者呈典型的上皮细胞形态,表达细胞角蛋白,并具血管纹边缘细胞的超微结构特征。后者呈成纤维细胞形态,表达波形蛋白,具有耳蜗螺旋韧带成纤维细胞的超微结构特征。结论培养出小鼠耳蜗血管纹边缘细胞及螺旋韧带成纤维细胞来源的原代上皮细胞及传代成纤维细胞,为体外研究提供了细胞模型及方法。     

CD133与喉癌肿瘤干细胞的实验研究

目的探讨CD133在人喉癌细胞系Hep-2中的表达，观察纯化的CD133阳性肿瘤细胞、CD133阴性肿瘤细胞及未分选Hep-2细胞在重症联合免疫缺陷小鼠中的成瘤性，筛选Hep-2细胞系肿瘤干细胞的表型。方法流式细胞仪检测CD133在Hep-2细胞系中的表达，免疫磁珠分选技术纯化CD133阳性肿瘤细胞，分选所得各细胞亚群细胞以及未分选细胞以一定的数量级注人重症联合免疫缺陷小鼠腹部皮下，比较其成瘤差异性。分选后的细胞进行了细胞周期的分析和HE染色观察生长形态，以排除成瘤差异由细胞周期分布不同及异源细胞引起。结果流式细胞仪示CD133在Hep-2细胞系中呈微量恒定表达，表达概率（3．15±0．83）％。免疫磁珠富集的CD133阳性肿瘤细胞并不处于细胞周期生长旺盛时相或优势分裂时相，而是与分选前周期分布相似且均匀的一类细胞；HE染色示细胞形态亦符合恶性肿瘤细胞的病理生长特性。体外成瘤试验显示16／20个CD133阳性细胞注射部位、7／20个CD133阴性细胞注射部位、10／20个未分选细胞注射部位可见肿瘤生长，统计学分析表明CD133阳性肿瘤细胞较CD133阴性细胞（χ^2=8．286，P=0．004）、未分选细胞（X2=3．956，P=0．047）在重症联合免疫缺陷小鼠体内具有很强的成瘤性。结论喉癌Hep-2细胞系中，CD133阳性癌细胞具有强的体内增殖能力，CD133为喉癌肿瘤干细胞的标志之一。     

CD133作为喉癌肿瘤起始细胞标志的实验研究

目的研究CD133在人喉癌细胞系Hep-2中的表达，观察纯化的CD133^＋肿瘤细胞体外生长特性，确定喉癌肿瘤起始细胞的表面标志。方法免疫荧光细胞化学技术及流式细胞仪检测喉癌Hep-2细胞系中的CD133表达，免疫磁珠分选技术纯化CD133^＋肿瘤细胞，体外培养并观察其增殖及分化能力。结果喉癌Hep-2细胞系中有3．22％的微量细胞CD133呈阳性表达，免疫磁珠富集的CD133^＋肿瘤细胞在无血清培养基中3、5、7d的吸光度分别为0.320、0．370、0．558，均高于相同条件下未分选细胞和CD133^-细胞；CD133^＋在培养体系中的比例逐日下降，至培养的第12天，由第1天的90．88％下降至4．53％。结论喉癌Hep-2细胞系中，CD133^＋癌细胞有比其他细胞亚群强的体外分化和增殖能力，CD133是肿瘤起始细胞的标志之一。     

Ⅱ型胶原酶体外分离并培养成年小鼠血管纹边缘细胞

目的探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外分离并培养成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞(marginal cell,MC)的方法。方法选取6只出生75±3 d的健康C57BL/6J小鼠,显微分离其耳蜗血管纹组织,以Ⅱ型胶原酶原代消化培养边缘细胞。倒置显微镜观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)法测细胞生长曲线,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫荧光法检测上皮细胞标志物——中间丝角蛋白18(CK18)和耳蜗血管纹的独特标志物KCNQ1的表达,RT-PCR法检测CK18和KCNQ1mRNA的表达。结果接种24～48 h后可见细胞贴壁增殖,形成大小不等的细胞岛,一周后细胞迅速生长,相互融合,紧密连接,形成单层极性上皮层,呈典型的"铺路石"样外观。透射电镜观察可见多角形细胞表面有较多微绒毛,胞浆内线粒体、内质网等细胞器丰富。免疫荧光检测显示CK18和KCNQ1蛋白表达阳性,RT-PCR结果示CK18和KCNQ1mRNA均有表达。结论采用原代消化培养技术可成功建立成年小鼠耳蜗血管纹MC的体外原代培养,为进一步研究成年期MC的功能和某些内耳疾病的发病机制提供了实验基础。     

Management of cancer of the base of tongue

The management of base of tongue cancer has evolved steadily over time. Organ preservation with primary radiation therapy has produced excellent oncologic and functional outcomes. Concomitant chemotherapy has become important in patients with locoregionally advanced disease. Planned neck dissection after organ preservation therapy continues to be an integral step for regional control. This article reports the results of a literature review of base of tongue cancer emphasizing a multidisciplinary approach to obtain optimal results in terms of cure and quality of life.     

耳廓开放性外伤的治疗方法探析

目的 探讨耳廓开放性外伤的治疗方法。方法 23耳耳廓开放性外伤经彻底清创，肝素生理盐水冲洗伤口后，对位缝合。术后用抗生素抗感染、丹参扩张血管、罂粟碱改善微循环。结果 23耳中2耳失访，18耳完全成活，1耳部分成活，2耳完全坏死。结论 耳廓撕裂伤、断伤、带有皮蒂的耳廓离断伤，由于断端双侧血管丰富，经对位缝合后容易成活。但耳廓完全离断伤由于缺乏血供，经对位缝合后不易成活，可采用去皮血管植入包埋法，带肌蒂皮瓣移植法或尝试显微外科技术施行血管吻合，以提高耳廓完全离断伤的成活率。