siRNA 沉默HIF-1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响

 目的 观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF-1α和VEGF的表达，探讨HIF-1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，RT-PCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF-1α沉默效果。结果 低氧条件下，EC9706细胞HIF-1amRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF-1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论 缺氧促使EC9706细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。     

干扰RNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对骨肉瘤细胞VEGF表达的影响

背景与目的:研究表明H IF-1α是肿瘤适应低氧微环境、诱导血管新生的一个主要调控因子。本研究通过观察体外低氧培养条件下骨肉瘤细胞系SaOS-2中H IF-1α和VEGF的表达,探讨H IF-1α在骨肉瘤缺氧激活血管新生调控途径中的作用。方法:CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境。半定量RT-PCR和免疫组化法分别检测不同缺氧时相中H IF-1α和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达。构建针对H IF-1α的短发夹状小干扰RNA真核表达载体并转染SaOS-2细胞。免疫印迹沉淀观察转染后H IF-1α的基因沉默效果,RT-PCR和ELISA双抗体夹心法检测H IF-1α短基因沉默后SaOS-2细胞中VEGF的变化。结果:低氧条件下,SaOS-2细胞H IF-1αm RNA水平稳定,蛋白表达显著升高;而VEGF m RNA和蛋白的表达均显著升高。构建的H IF-1α短发夹状小干扰RNA表达载体转染SaOS-2细胞后能够显著下调H IF-1α基因的表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论:缺氧促使SaOS-2细胞H IF-1α在蛋白水平表达升高,H IF-1α通过转录激活VEGF的机制促进骨肉瘤缺氧状态下的血管新生。     

HIF-1α基因干扰对大鼠CBRH-7919肝癌细胞HIF-1α与VEGF表达影响的研究

目的:探讨沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对肝癌细胞在缺氧状态下表达HIF-1α及血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法:选用大鼠CBRH-7919肝癌细胞株作为研究对象,利用氯化钴(CoCl2)模拟缺氧状态,构建3组特异性较强的HIF-1α siRNA表达载体,采用小分子RNA干扰技术沉默细胞HIF-1α的基因表达,分别利用real time RT-PCR和蛋白质印迹法检测肝癌细胞HIF-1α和VEGF在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果:在不同浓度CoCl2模拟缺氧条件下,随着CoCl2浓度的增高及时间的推移,肝癌细胞HIF-1α和VEGF的表达(mRNA及蛋白水平)较常氧对照组(0 μmol/L CoCl2)显著增多,差异均有统计学意义,P＜0.05.应用3组不同HIF-1α和siRNA表达载体转染缺氧条件下的肝癌细胞后,细胞的HIF-1α和VEGF的基因(mRNA)表达量与未转染HIF-1α siRNA表达载体对照组相比较明显减少,同步检测两者的蛋白表达亦明显减少,与对照组差异均有统计学意义,P＜0.05.结论:缺氧可以诱导肝癌细胞HIF-1α和VEGF的表达,siRNA沉默HIF-1α能显著抑制缺氧状态下诱导的VEGF表达.     

siRNA靶向沉默COX-2对宫颈癌细胞VEGF、EGFR表达的影响

目的 探讨siRNA靶向沉默环氧合酶-2(COX-2)基因对宫颈癌HeLa细胞血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法 以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,采用COX-2 siRNA转染HeLa细胞作为转染组,以未转染的HeLa细胞作为空白对照组,以阴性对照siRNA转染HeLa细胞作为阴性对照组.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2、VEGF、EGFR基因的表达水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测COX-2、VEGF、EGFR蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Tran-swell小室检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 RT-PCR结果显示,转染组的COX-2、VEGF、EGFR基因表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).Western blot结果显示,转染组的COX-2、VEGF、EGFR蛋白表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).MTT检测结果显示,转染组的细胞增殖抑制率高于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).流式细胞仪检测结果显示,转染组的细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).Transwell小室检测结果显示,转染组的细胞穿透率低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).结论siRNA靶向沉默COX-2基因能够抑制HeLa细胞中VEGF和EGFR的基因及蛋白表达水平,促进HeLa细胞凋亡,抑制HeLa细胞增殖,降低HeLa细胞的迁移及侵袭能力.     

人食管癌细胞缺氧培养条件下HIF-1α和VEGF表达的研究*

探讨人低分化食管鳞癌细胞系EC- 109、CaEs-17在缺氧条件下,缺氧诱导因子-1 α 及血管内皮生长因子随缺氧时间不同,在基因水平和蛋白水平上的表达。方法:1）体外培养人低分化食管鳞癌细胞系EC- 109、CaEs-17,利用免疫荧光染色方法观察细胞在缺氧培养条件下HIF-1 α 和VEGF蛋白表达情况。2）提取总RNA,逆转录为cDNA ,并进行实时PCR ,观察细胞在不同缺氧时间,hif- 1 α 及vegf 基因表达峰度及相互关系。结果:1）EC- 109、CaEs-17细胞在缺氧培养条件下HIF-1 α 、VEGF蛋白表达增加。2）EC- 109、CaEs-17细胞在缺氧培养条件下hif- 1 α 、vegf 基因表达上调。3）EC- 109、CaEs-17细胞在缺氧条件下vegf 表达峰度上调滞后于hif- 1 α 表达,自缺氧培养8h 起,hif- 1 α 基因表达峰度持续高于vegf 基因表达。结论:缺氧环境是诱导人食管癌细胞缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达上调的因素之一,vegf 基因表达滞后于hif- 1α基因表达。      

CD147 siRNA对乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2与VEGF表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨CD147 siRNA对乳腺癌细胞VEGF、MMP-2和HIF-1αmRNA表达及细胞凋亡的影响。方法:对乳腺癌细胞株MDA-MB-435转染CD147 siRNA真核表达载体,实时定量PCR法及Western blot检测VEGF、MMP-2和HIF-1αmRNA与蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞的早期凋亡率。结果:转染CD147 siRNA沉默CD147基因后,乳腺癌细胞VEGF、MMP-2和HIF-1α蛋白与mRNA表达均明显下降(P<0.05),而细胞的早期凋亡率则显著增高(3.32%vs 15.21%,P<0.05)。结论:CD147作为一种重要的调控分子,可以下调乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2及VEGF的表达,从而参与了乳腺癌的增殖、转移等过程。     

HIF-1α与HIF-2α在胃癌中的表达及临床意义

目的:检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)和缺氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2,HIF-2α)在胃癌中的表达,分析其在癌和癌旁组织中的表达差异,并探讨其与胃癌临床病理特征的关系.方法:收集62例胃癌患者术后癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学染色及Western blot方法检测HIF-1α和HIF-2α的蛋白表达水平,并分析两者的相关性及其与胃癌临床病理的关系.结果:免疫组化结果显示,胃癌组织中HIF-1α 和HIF-2α 的表达均较癌旁组织明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测发现胃癌组织中HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表达水平均明显高于癌旁组织.相关分析发现HIF-1α在胃癌组织中的高表达与T分期、肿瘤直径及胃癌不同发病部位有显著相关,并且多元Logistic回归分析显示,均为HIF-1α表达异常的独立相关因素(P<0.05);HIF-2α在胃癌组织中的高表达与T分期、肿瘤直径和淋巴结转移显著相关(P<0.05);HIF-1α与HIF-2α在胃癌患者组织中的高表达并无明显相关.结论:HIF-1α和HIF-2α在胃癌组织中异常表达,但无明显相关;提示两者可能存在不同的生理功能和调控机制.     

缺氧对骨肉瘤SaOS-2细胞系HIF-1α和VEGF表达的影响

目的：观察缺氧条件下骨肉瘤SaOS-2细胞系缺氧诱导因子HIF-1α和血管生长因子VEGF表达的变化。方法：建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型，观察缺氧培养不同时相(8、16、24h)HIF-1α和VEGF的表达。半定量RT—PCR方法检测HIF-1α和VEGF mRNA的转录水平，免疫组化(SP法)和免疫印迹(Western blot)检测HIF-1α蛋白表达情况，免疫组化和ELISA法检测细胞和培养上清液中VEGF蛋白表达。结果：缺氧处理后，HIF-1α mRNA转录水平没有明显改变，蛋白表达随缺氧时间延长而升高。VEGF mRNA以及蛋白的表达在缺氧条件下均显著增强。结论：骨肉瘤细胞系SaOS-2在缺氧条件下．缺氧诱导因子HIF-1α和血管牛长因子VEGF蛋白表达上调。     

HIF-1α对人肝癌 HepG2 细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人肝癌细胞株HepG2体内生长的影响,并探讨其可能机制.方法将HIF-1α转入人肝癌细胞HepG2中,建立人肝癌裸鼠模型,观察其生长.切除瘤灶、称瘤重.标本用免疫组化和western-blot检测HIF-1α和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果HepG2细胞对HIF-1α敏感,细胞生长速度加快.结论 HIF-1α体内可促进肝癌HepG2的生长,其机制可能与其促血管生成有关.     

下咽鳞癌中HIF-1α与VEGF表达的临床治疗意义

目的 分析乏氧诱导因子- 1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)在下咽鳞癌及癌旁正常黏膜组织中的表达,探讨HIF-1α、VEGF在下咽鳞癌中表达的临床意义。方法 对62例患者应用免疫组化检测HIF-1α、VEGF的表达,并分析其与患者临床病理特征及预后关系。结果 HIF-1α、VEGF在鳞癌组织中的表达...     

HIF-1α反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞系MG-63 HIF-1α和VEGF表达的影响

目的：观察缺氧诱导因子HIF—1α反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASODN）在缺氧环境下对骨肉瘤细胞系MG-63 HIF—1α和血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法：设计针对HIF—1α RNA亚基模板序列的反义、正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotides，SODN），并建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型，观察缺氧培养不同时相HIF-1α反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞系MG-63 HIF-1α和VEGF的表达的影响。RT-PCR方法检测HIF-1α和VEGF mRNA水平，免疫组化和免疫印迹方法检测HIF-1α和VEGF蛋白表达情况。结果：与常氧组比较。单纯缺氧组及SODN缺氧组的HIF-1α转录水平未见明显改变。蛋白表达水平却随缺氧时间延长明显升高：而VEGF mRNA以及蛋白的表达水平较常氧组均显著增强。然而在ASODN缺氧组。HIF-1α、VEGFmRNA活性以及蛋白的表达水平明显减弱，且HIF-1α蛋白水平与VEGF转录活性有明显的相关性。结论：在缺氧环境下，转染HIF-1α反义寡核苷酸能够抑制HIF-1α活性。从而使VEGF mRNA和蛋白的表达水平明显下降。     

胃癌中缺氧诱导因子-1α表达及其与VEGF的关系

[目的]探讨胃癌组织中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达及其与血管内皮生长因子（VEGF）的关系。[方法]用免疫组织化学SP法检测80例胃癌中HIF-1α、VEGF的表达，并与30例胃癌旁不典型增生组织、30例胃正常组织作为对照：分析HIF-1α、VEGF与胃癌临床病理因素及预后的关系。[结果]HIF—1α和VEGF在胃癌中的阳性表达分别为47．5％（38／80）和71.3％（57／80），明显高于胃癌旁不典型组织及胃正常组织（P〈0．05）。HIF-1α、VEGF与胃癌的TNM分期以及肿瘤浸润深度、淋巴结转移等相关（P〈0．05），与组织学分级无关。胃癌中HIF—1α与VEGF的表达呈显著性正相关（r=-0．328，P〈0．01）。[结论]HIF—1α、VEGF均在胃癌中过表达并且与胃癌的侵袭、转移及预后密切相关，HIF-1α可能通过上调VEGF的表达，在胃癌的发生、发展中发挥重要作用。     

鼻咽癌细胞在乏氧-再氧合过程中HIF-1α和VEGF基因mRNA水平表达变化的初步研究

目的：探讨鼻咽癌细胞在乏氧－再氧合过程中乏氧诱导因子1α（HIF－1α）和血管内皮生长因子（VEGF）基因mRNA水平表达的变化。方法：鼻咽鳞癌细胞系（CNE）分别在富氧、乏氧8h、乏氧16h和乏氧16h后再氧合4h4个不同条件下培养后，应用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法半定量测定HIF－1α和VEGF基因的mRNA水平的表达。结果：在4个不同培养条件下的CNE细胞的HIF－1α基因的mRNA水平表达无明显变化，而VEGF基因的mRNA水平表达经乏氧8h和乏氧16h培养后均明显升高，在乏氧16h后再氧合4h培养后的表达则显著下降。结论：乏氧能引起鼻咽癌细胞的VEGF基因mRNA水平高表达，而对HIF－1α基因的mRNA表达水平影响不明显，提示乏氧可能不是通过HIF－1α基因的转录途径来诱发VEGF基因的高表达而达到提高肿瘤侵袭性的目的。     

Ⅰ～Ⅲ期胃癌中VEGF、 HIF-1α和TGF-β1表达的临床意义及其预后价值

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和转移生长因子-β1（TGF-β1）在Ⅰ～Ⅲ期胃癌中的表达及其临床意义和预后价值。方法 收集2004年1月至2006年12月在解放军总医院接受根治性手术且TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期的胃癌病例。采用组织芯片及免疫组化法检测VEGF、HIF-1α和TGF-β1的表达,并分析其表达与临床病理特征及预后的关系。结果 全组343例患者中,VEGF、HIF-1α和TGF-β1的阳性表达率分别为493％、30.9％和39.1％,且三者表达两两相关。全组患者的中位随访时间为70.0个月,至随访截止时间,出现复发或转移者232例,死亡218例,中位无疾病生存期（DFS）为23.0个月,中位生存期（OS）为31.1个月。单因素分析显示,年龄、是否全胃切除、是否含印戒细胞癌、Lauren分型、脉管癌栓、肿瘤直径、TNM分期、辅助化疗、VEGF及HIF-1α表达与DFS和OS有关（P＜005）;VEGF、HIF-1α和TGF-β1三者共阳性组的中位DFS（8.6个月）和中位OS（17.7个月）均小于双阳性、单阳性及三者共阴性组（P＜0.05）。Cox多因素分析显示,是否全胃切除、是否辅助化疗、TNM分期、VEGF及HIF-1α表达均为影响DFS和OS的独立预后因素。结论 对于接受根治性手术治疗的Ⅰ～Ⅲ期胃癌患者,VEGF和HIF 1α阳性表达可能是影响胃癌患者的不良预后因素。     

人HIF-1α基因沉默肺癌细胞株的筛选及鉴定

乏氧条件下，肿瘤细胞基因不稳定，突变的基因型影响信号传导途径，细胞凋亡受抑制，恶性程度升高，转移能力增加，对放化疗的敏感性降低。在乏氧应答中起关键作用的是由仅和B亚基组成乏氧诱导因子-1（HIF-1）。HIF-1α作为肿瘤治疗靶基因正引起大家关注。建立HIF-1α基因沉默的细胞系模型，可为研究HIF-1α在肺癌乏氧应答中的作用和通过阻断HIF-1α基因表达为治疗肺癌提供工具。     

雷帕霉素对人宫颈癌HeLa细胞增殖和HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨不同浓度雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用及对HIF-1α、VEGF表达的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测分别以不同浓度雷帕霉素处理的体外培养人宫颈癌HeLa细胞的抑制率,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测各组细胞HIF-1 α、VEGF mRNA和蛋白的表达.结果 不同浓度雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞的生长有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性;随雷帕霉素浓度增加细胞内HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达均呈下调趋势.结论 雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞的生长有抑制作用并呈剂量依赖性,雷帕霉素具有明显下调HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达的作用.     

沉默I2PP2A基因对胃癌BGC-823细胞增殖和迁移能力的影响

目的 探讨siRNA沉默I2PP2A基因表达对人胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的影响及其可能的分子机制。方法 脂质体转染法将靶向I2PP2A的短发夹状RNA（short hairpin RNA, shRNA）转染BGC-823细胞;Real-time RT-PCR和Western blot观察转染后胃癌BGC-823细胞I2PP2A mRNA和蛋白表达的变化;WST-1法和Transwell小室分别检测各组细胞增殖和细胞迁移能力的变化;最后采用蛋白质印迹分析法检测三组胃癌细胞中cyclin D1和MMP-9蛋白的表达。结果 转染I2PP2A siRNA后胃癌BGC-823细胞的I2PP2A mRNA及蛋白表达明显受抑制;I2PP2AmRNA和蛋白表达下调抑制胃癌BGC-823细胞的增殖和迁移,并降低cyclin D1和MMP-9蛋白的表达。结论 I2PP2A表达下调介导的胃癌细胞增殖抑制和迁移降低可能与cyclin D1和MMP-9表达下调密切相关,I2PP2A可能成为胃癌治疗的新靶点之一。     

HIF-1α和HIF-2α在肝癌细胞中的时相差异表达

背景与目的:缺氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor-2 alpha, HIF-2α)与缺氧诱导因子1α结构功能相似却不可相互替代;两者在缺氧过程中的表达不一致.本研究旨在检测缺氧状态下肝癌细胞中HIF-2α和HIF-1α的时相表达差异并探讨其可能的调节机制和意义.方法:以1%低氧培养箱模拟细胞低氧环境,检测人肝癌SMMC- 7721细胞中HIF-1α和HIF-2α mRNA量和蛋白量,以及反义HIF-1α(natural antisense hypoxia inducible factor-1α,aHIF)的mRNA量.同时应用氯化钴(CoCl2)和转录抑制剂5,6-二氯苯并咪唑1-beta-D-呋喃核糖苷(5,6-dichlorobenzimida- zole-1-beta-d- ribo furanoside,DRB)检测HIF-1α和HIF-2α mRNA的半衰期,评价HIF-1α和HIF-2α mRNA的稳定性.结果:急性缺氧迅速诱导HIF-1α和HIF-2α蛋白在细胞内堆积.随着缺氧时间延长HIF-1α mRNA的稳定性下降,其蛋白表达降低,而HIF-2α和aHIF蛋白表达持续增高.结论:HIF-2α可能在肿瘤的放疗和化疗抗性以及与肿瘤侵袭和转移方面起着重要作用.aHIF参与了HIF-1α mRNA的调节.     

缺氧诱导因子-1α、VEGF表达与胃癌肝转移及肿瘤血管生成的关系

[目的]探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）在胃癌组织中的表达及其意义。[方法]采用免疫组化法检测91例胃癌组织（其中32例伴有肝转移）和20例非肿瘤胃黏膜组织中HIF-1α与VEGF的表达。[结果]HIF-1α在伴有和不伴有肝转移胃癌组织中阳性表达率分别为84.4%和50.8%（P=0.002）;VEGF在伴有和不伴有肝转移胃癌组织中阳性表达率分别为81.3%和54.2%（P=0.01）。HIF-1α阳性组微血管密度（MVD）显著高于HIF-1α阴性组（P=0.0001）;VEGF阳性表达与HIF-1α阳性表达呈正相关（P=0.001）。[结论]在伴有肝转移胃癌组织HIF-1α高表达,其可能通过调节其下游基因VEGF表达参与胃癌的血管形成、浸润和肝脏等远处转移。     

RNA干扰HIF-1α对Eca109食管癌细胞放疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子1α(HIF-1α)对Eca109食管癌细胞放疗敏感性的影响。方法构建干扰HIF-1α质粒pSilencer 2.1 HIF-1α,采用实时荧光定量Real-time PCR、Western Blot方法验证干扰效果,通过MTT、流式细胞仪和克隆形成试验观察RNA干扰HIF-1α对Eca109食管癌细胞的放疗敏感性的影响。结果 RNA干扰可抑制Eca109细胞中HIF-1α和VEGF mRNA转录和蛋白的表达;HIF-1α基因沉默后细胞凋亡增加,且肿瘤细胞对放疗的敏感性增加。结论靶向HIF-1α的shRNA能有效抑制Eca109食管癌细胞的HIF-1α和VEGF基因表达,促进细胞凋亡,增加肿瘤细胞的放疗敏感性。