绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞的超微结构特征

背景：研究表明,绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞免疫学表型、细胞周期、分化潜能等均未发生明显改变。目的：进一步观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞超微结构的影响。方法：分离培养成人骨髓间充质干细胞,抗CD34、抗CD105免疫细胞化学染色鉴定,选第3代细胞进行绿色荧光蛋白标记,超薄切片后用透射电镜观察细胞超微结构,以未经绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞为对照。结果与结论：骨髓间充质干细胞表达CD105,不表达CD34。绿色荧光蛋白标记后,骨髓间充质干细胞细胞质发出绿色荧光,绿色荧光主要集中于细胞核周围的胞浆内,远离细胞核的胞浆内荧光强度逐渐减弱。相对于未标记的骨髓间充质细胞,经绿色荧光蛋白标记后细胞粗面内质网、高尔基体等细胞器较多,而线粒体相对较少;另外,脂滴和＂空泡＂样结构也多一些。结果证实绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞性状的影响较为局限,是一种较为理想的细胞标记示踪剂。     

绿色荧光蛋白标记对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

目的：观察腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞的标记效率及标记对骨髓间充质干细胞生长的影响，为进一步追踪研究骨髓间充质干细胞奠定基础。 方法：实验于2006—11/2007—03在四川大学华西组织胚胎学与神经生物学实验室完成。①实验材料：成年雄性SD大鼠，体质量100～120g，由四川大学实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，传代扩增，应用免疫细胞化学方法对培养的骨髓间充质干细胞进行鉴定。将生长到约80％融合的第3代骨髓间充质干细胞随机分为绿色荧光蛋白标记组和对照组。绿色荧光蛋白标记组加入1：100稀释的腺病毒（咿dEasy-1-pAdTrack-CMV）上清液，对照组加入磷酸盐缓冲液。③实验评估：观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响。 结果：体外培养的原代骨髓间充质干细胞24h内可见有少量贴壁细胞，8～10d左右达到70％～80％汇合。免疫细胞化学检测第3代骨髓间充质干细胞显示，CD44和CD90表达阳性，而CD14和CD34表达阴性。生长曲线表明，绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响。 结论：腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞效率高，标记后对细胞的生长无明显影响。     

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

背景：转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白,与传统病毒、质粒转染相比,能在活细胞中稳定地表达,可较快筛选其修饰的细胞。目的：观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法：取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型,并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化,采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。结果与结论：成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表达 CD90和CD105,不表达或弱表达CD14和CD45。经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积,经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。结果表明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,可作为良好的示踪因子。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化

背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚。“环境诱导分化学说”认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用。骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验。单位:西安交通大学第一医院心内实验室。材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成。SD大鼠60～80g、90～110g,雌雄不限,由本校动物中心提供。PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen)。方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照。骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%。细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室。将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%。用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。③骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞混合培养,观察细胞形态变化。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果。②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果。结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性。骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性。②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90。③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周。④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好。骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性。骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞。②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力

背景:骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后,其分布和定居情况不明,这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床。目的:探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),经不同途径移植到同种异体大鼠,其定居于肝脏的能力。设计:析因设计。单位:广东省第二人民医院普外科/中山大学博士后科研基地,南方医科大学珠江医院普通外科,中山大学附属第三医院器官移植科。材料:实验于2003-01/2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成。选取清洁级成年SD大鼠36只,随机分为5组:CCL4 门静脉移植组(6只)、门静脉移植对照组(6只)、CCL4 尾静脉移植组(6只)、尾静脉移植对照组(6只)、混合组(12只)。方法:①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,以细针移植骨髓间充质干细胞悬液,移植量为0.5mL/100g。②CCL4 门静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。门静脉移植对照组:骨髓间充质干细胞移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。CCL4 尾静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。尾静脉移植对照组:移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。混合组:前4组条件下,各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞;另设CCL4喂养3d和正常喂养大鼠各2只,不行骨髓间充质干细胞移植。③于移植后的第3,7天,通过荧光定量PCR检测各组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠肝脏的表达。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外扩增及表型鉴定结果。②绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞结果。③移植同源异体骨髓间充质干细胞后大鼠的生长情况观察。④各组肝脏组织中绿色荧光蛋白阳性DNA数的定量检测结果。结果:实验选取SD大鼠36只全部进入结果分析。①Percoll梯度分离液分离大鼠骨髓,所获得的细胞传代、扩增后,形态呈基本一致的梭性。细胞表面不表达CD34与CD45,而表达CD29,CD44,CD90等骨髓间充质干细胞的表面标志,是骨髓中区别于造血干细胞的另一群处于未分化状态的非定向干细胞。②骨髓间充质干细胞转染24h后即可见发绿色荧光的细胞。48～72h阳性细胞明显增多,强度增强,高倍视野下转染率达20%～30%,多为明亮的绿色荧光的细胞。作为对照的骨髓间充质干细胞中未发现发绿色荧光的细胞。③所有大鼠从不同途径移植标记或未标记的同源异体骨髓间充质干细胞后,第1天精神、食欲差,少活动;移植后第2天基本恢复正常饮食和精神,各组大鼠之间无明显差异。④除混合组外,其余各组于移植术后第3,7天,肝脏内均可检测到含绿色荧光蛋白阳性细胞。且CCL4 门静脉移植组、CCL4 尾静脉移植组肝脏组织中的绿色荧光蛋白阳性DNA数显著高于门静脉移植对照组、尾静脉移植对照组升高(P<0.05)。结论:干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损有关,与移植途径关系不密切。正常动物肝脏未受损情况下,干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径、移植后时间相关。     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.目的:观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成.材料:C57BU6小鼠4～6周龄.体质量20g,雌雄不拘.方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞.参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%.用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块.然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10~6/cm~2浓度接种75 cm~2培养瓶.对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-Dil标记.主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度.结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形,多角形和扁平形.3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45.③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构.在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒.④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上.流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞.结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪.     

绿色荧光蛋白转染大鼠骨髓间充质干细胞及体外向神经元样细胞的分化

背景:成年骨髓间充质干细胞诱导后在体外可分化为神经元样细胞,利用细胞转染技术让其表达绿色荧光蛋白,便于在动物模型体内跟踪观察。目的:观察增强型绿色荧光蛋白转染的骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞的能力,拟为增强型绿色荧光蛋白基因作标志物对外源性骨髓间充质干细胞进行体内追踪做准备。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在中国医科大学医学分子生物学国家重点实验室完成。材料:清洁级成年Wistar大鼠32只,由中国医科大学实验动物部提供。增强型绿色荧光蛋白质粒为Sigma公司产品。方法:取大鼠两侧股骨及胫骨,Percoll密度梯度离心 贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞,达90%融合后消化传代扩增。由脂质体介导,将含有增强型绿色荧光蛋白质粒cDNA转入骨髓间充质干细胞,经G418筛选后,按0.4×109L-1接种,加入含FBS、碱性成纤维细胞生长因子的DMEM预诱导24h,更换培养液后再以含BHA、DMSO的无血清DMEM诱导5h～6d。主要观察指标:荧光显微镜观察细胞转染情况,免疫细胞化学染色检测转染细胞诱导后神经元表面抗原的表达。结果:携带增强型绿色荧光蛋白基因的骨髓间充质干细胞生长旺盛,转染24h后在细胞核中就可见弥散绿色荧光,转染48h后绿色荧光更加集中,在细胞核中聚集成团块、颗粒状,体外培养3个月后仍能够高水平表达增强型绿色荧光蛋白。与未转染细胞比较,转染细胞诱导后其神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、巢蛋白阳性率均无明显变化(P>0.05),胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达。结论:骨髓间充质干细胞体内能稳定、高效和持久地表达增强型绿色荧光蛋白,转染后生物学性状未发生改变,体外在细胞因子和氧化剂的诱导作用下仍可以分化为神经元样细胞。     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景:国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少.目的:观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况.方法:选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1～2)、生理盐水组(L2～3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3～4,L4～5,L5～6).空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25 μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109 L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25 μL.移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量.结果与结论:绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞.移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P<0.001).提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活.     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

蛛网膜下腔移植SPIO标记的MSCs在大鼠脊髓损伤模型的MR活体示踪研究

目的 将超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记的骨髓间充质干细胞BMSCs通过蛛网膜下腔置管移植到脊髓损伤大鼠模型,以磁共振成像(MRI)观察其迁移和分布.方法 用携带绿色荧光蛋白的腺病毒(AD5/F35-EGFP)和SPIO标记分离纯化后的BMSCs,免疫荧光和普鲁士蓝染色显示标记效果.制作大鼠脊髓损伤模型,并将蛛网膜下腔置管成功的10只SD大鼠随机分为2组,将标记细胞(实验组,n＝5)和未标记细胞(对照组,n＝5)经蛛网膜下腔移植到模型鼠.在移植前、移植后3、7、14天用3T MRI对移植细胞进行活体示踪,并与损伤脊髓组织切片GFP表达进行对照.结果 AD5/F35-EGFP和SPIO可以高效地标记BMSCs,标记细胞表达绿色荧光,普鲁士蓝染色显示BMSCs胞质内出现蓝色铁颗粒,标记对细胞增殖活力没有明显的影响.蛛网膜下腔移植标记细胞到大鼠脊髓损伤模型,MRI显示损伤区域逐渐增强的T2低信号,组织切片荧光检查与MRI结果一致,未标记细胞组MRI无明显低信号改变.结论 SPIO纳米颗粒可有效标记BMSCs.蛛网膜下腔移植的BMSCs可迁移到脊髓损伤区域;利用MRI可对移植细胞进行活体示踪.     

PKH-26标记骨髓间充质干细胞气管移植的体内示踪

背景:PKH-26已经被成功应用于标记骨髓间充质干细胞并进行体内示踪。目的:通过气管移植合并静脉移植PKH-26标记的骨髓间充质干细胞评价PKH-26的示踪效果,并检测骨髓间充质干细胞在体内向受损组织的迁移情况。方法:用贴壁法进行骨髓间充质干细胞的原代细胞培养,以PKH-26标记3～5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入气管移植的受体大鼠体内,用等量的PBS注射作为实验对照。结果与结论:用PKH-26进行细胞骨髓间充质干细胞标记后,荧光显微镜下观察可见几乎所有骨髓间充质干细胞均有红色荧光。移植后8周仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记。远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。结果表明骨髓间充质干细胞经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定植,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定植于移植段气管。PKH-26的红色荧光标记稳定性高,是可应用于长期观察的无降解的荧光标记物。     

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P<0.05)。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。     

立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞

背景: 有关利用菲立磁体外细胞标记研究选择的动物主要是啮齿类动物,而研究灵长类动物食蟹猴的报道目前仍是空白.目的:观察利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞方法的可行性.方法:无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞,普鲁士蓝染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记食蟹猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的增殖和分化能力.结果与结论:菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右.光镜和电镜下骨髓基质细胞胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡.菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显影响.提示菲立磁可以用来体外标记食蟹猴骨髓基质细胞.     

骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的旁分泌机制

背景:骨髓间充质干细胞已用于肾缺血再灌注损伤修复的实验动物研究。目的:探讨骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的旁分泌机制。方法:体外培养、纯化并体外DAPI标记大鼠骨髓间充质干细胞,经下腔静脉移植入肾缺血再灌注损伤模型大鼠体内,观察骨髓间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤肾功能的保护作用以及在受体鼠体内的迁移情况,并应用免疫组织化学法检测骨髓间充质干细胞治疗后第2天缺血肾脏组织中血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α细胞因子的表达。结果与结论:与注射生理盐水的对照组比较,细胞移植组大鼠血清肌酐和尿素氮水平在移植后第1、2天明显降低(P<0.05),但细胞移植组移植后第1、2天肾组织中均未见DAPI阳性细胞;第3、4天则逐渐可见DAPI阳性细胞。免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,移植后第2天肾组织中可见较多血管内皮生长因子阳性细胞,而肾组织中肿瘤坏死因子α阳性细胞明显减少。结果显示旁分泌机制参与了骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤。     

体外磁标记骨髓基质细胞移植治疗大鼠创伤性脑损伤的在体MRI观察

目的 采用高场MR在体监测超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)在脑损伤模型大鼠脑内的分布与迁移.方法 首先进行BMSCs体外培养,然后采用SPIO标记BMSC;采用Feeney法制作创伤性脑损伤模型(TBI).脑损伤24 h后于损伤区周围立体定向移植BMSCs,并于移植后1、3天及1、3周行MR检查.结果 倒置相差显微镜下观察,标记BMSCs的细胞内含有棕黄色铁颗粒,普鲁士蓝染色呈阳性;电镜下胞浆内可见散在分布的铁颗粒.细胞移植后MRI可见移植部位在MR各序列上均呈点状低信号,尤以磁敏感加权成像(SWI)上显示明确.结论 高场MRI能够在活体内连续示踪观察SPIO标记的BMSCs的分布与迁移,且SWI序列最为敏感.     

血红素氧合酶1提高骨髓间充质干细胞在梗死后心脏的存活

背景:移植骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)修复梗死后心功能受到围移植期移植细胞大量死亡的限制.因此寻找一种保护因子对移植细胞提供保护至关重要.目的:观察血红素氧合酶1(heme oxygenase,HO-1)对BMSCs在梗死后心脏生存的影响.方法:体外分离扩增培养大鼠BMSCs,Adv-hHO-1、Adv-GFP分别转染,移植前DAPI标记.结扎左前降支1 h后,分别将DAPI-hHO-1-BMSCs、DAPI-GFP-BMSCs多点注射到大鼠心脏梗死区周边,对照组注射等量PBS.结果与结论:Adv-hHO-1转染BMSCs后获稳定表达.仅hHO-1-BMSCs组稳定表达hHO-1 mRNA;hHO-1-BMSCs组血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子表达均高于其他两组(P < 0.01);存活BMSCs数量在第3,7天均明显高于GFP-BMSCs组(P < 0.05);大鼠心功能各项参数明显优于其他两组(P < 0.01).移植4周后,HO-1-BMSCs组梗死区周边毛细血管密度明显高于GFP-BMSCs组和对照组(P < 0.01),且胶原蛋白沉积减少,心室壁变厚,梗死面积较其他两组明显缩小(P < 0.01).提示HO-1提高移植到梗死心脏BMSCs的存活,HO-1协同BMSCs抑制心室重构,改善心功能.     

不同途径骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤大鼠海马的作用

背景:近年来骨髓间充质干细胞移植在中枢神经系统中的应用越来越广泛,研究其最佳的移植方式具有重要意义。目的:观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠海马神经元的影响。方法:分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,以PKH26标记第3代骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察并流式细胞仪检测标记率;采用改进Feeney法制作脑损伤致海马神经元损伤模型。60只Wistar大鼠随机分为3组,脑损伤区移植组:造模后注射含骨髓间充质干细胞的生理盐水10μL;尾静脉移植组:自尾静脉注入含骨髓间充质干细胞的生理盐水1mL;创伤性脑损伤组:不给予任何处理。结果与结论:荧光显微镜观察PKH26标记的BMSCs呈球形,呈现均匀分布的红色荧光;PKH26标记BMSCs的阳性率>99%。脑损伤区移植组大鼠学习记忆功能明显好于其他两组,PKH26阳性细胞和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量脑损伤区移植组多于尾静脉移植组,尾静脉移植组多于创伤性脑损伤组(P<0.05)。GAP-43mRNA的表达脑损伤区移植组高于尾静脉移植组,尾静脉移植组高于创伤性脑损伤组(P<0.05)。提示移植骨髓间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠海马神经元有保护作用,脑损伤区移植优于尾静脉移植。