细菌荧光酶报告基因载体构建及在Hela细胞中的表达*

采用ＰＣＲ点突变技术,构建含有细菌荧光酶融合ｌｕｘＡＢ报告基因的重组哺乳动物载体ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ,脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染和Ｇ４１８抗性筛选稳定转染的Ｈｅｌａ细胞。ＰＣＲ和酶切电泳证明构建的正确性;经稳定转染ｐｃＤＮＡ_３－ｌｕｘＡＢ的Ｈｅｌａ细胞,用发光仪可测得较强的发光强度（最大值为４．１２ｍＶ／４０μｇ细胞总蛋白粗提物）。而亲本及ｐｃＤＮＡ_３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞则在本底值范围,ｐｃＤＮＡ_３<     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

小鼠白细胞介素12双顺反子真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

克隆小鼠白细胞介素１２（ＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,并构建同时含ｍＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５ｃＤＮＡ的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达．白细胞介素１２是由巨噬细胞,树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子,对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用．利用脂多糖（１００ｐｇ／ｍｌ）和小鼠重组干扰素（ＩＦＮ－γ５００Ｕ／ｍｌ）体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞,从中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素１２（ｍＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５全长ｃＤ－ＮＡ．ＰＣＲ产物经酶切后,分别克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体中,序列测定结果与文献报道序列一致．然后利用脊髓灰质炎（Ｐｏｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）连接ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,亚克隆至ｐｃＤＮＡ３载体中,构建成含ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ双顺反子真核表达载体,即ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２,ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ同时受ｐｃＤＮＡ３中ｈＣＭＶ启动子驱动,将ｐ４０及ｐ３５转录至同一ｍＲ－ＮＡ上．通过ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ将ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２转染ＣＯＳ－７细胞,７２ｈ收集培养上清,测定ｍ     

小鼠4.5S RNA逆转座子对Luc基因表达的影响

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Ｌｕｃ基因作为报道基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点,构建了含４．２ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０－４．５Ｓ。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１、ＳＰ２／０和人乳腺癌细胞Ｂｃａ６１。结果表明,小鼠４．５ＳＲＮ     

鸡平滑肌肌球蛋白轻链激酶在NIH 3T3细胞中的表达

肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ）在调节平骨肌细胞收缩过程中具有十分重要的作用。本言语通过将ＭＬＣＫｃＤＮＡ插到质粒ｐＢＫｒｓｖ中构建ｐＢＫｒｓｖ－ＭＬＣＫ,并转染至ＮＩＨ３Ｔ３细胞中,ＤＮＡ－ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表达转染细胞可表达ＭＬＣＫ。活生分析表明所表达的ＭＬＣＫ具有生物学活性。为进一步研究ＭＬＣＫ在信号传导,调节平骨肌收缩等作用奠定了基础。     

血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓？…

朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取细胞总ＲＮＡ,采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到ＶＥＧＦ受体Ｆｌｔ－１胞外区前３个ＩｇＧ样区域ｃＤＮＡ片段（Ｆｌｔ－１ｎ３）。将获得的受体基因克隆到真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１中,得到重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌｔ－１ｎ３,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）,用Ｇ４１８筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选     

人促血小板生成素受体c—Mpl编码区全长cDNA的克隆及其稳定？…

以人ＨＥＬ细胞总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了人促血小板生成素受体ｃ－Ｍｐｌ编码区全长１．９ｋｂ ｃＤＮＡ,测序结果表明与已报道的序列一致。然后构建了ｃ＝ｍｐｌ的ｐｃＤＮＡ３表达载体ｐｃＭＰＬ,转染不表达ｃｍｐｌ的Ｋ５６２细胞后,经Ｇ４１８抗性筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｌｂｏｔ检测证实获得稳定表达ｃ－ｍｐｌ的细胞株。为进一步研究ｃ－Ｍｐｌ的生物学功能提供有用的实     

人血小板生成素（hTPO）全长cDNA克隆及其在CHO细胞中的表达

以人胎肝ｍＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了人ＴＰＯ编码区全长ｃＤＮＡ,全序列测定结果表明与国外报道序列一致;进而构建了ｐｃＤＮＡ３－ＴＰＯ永久表达载体,转染ＣＨＯ细胞后经Ｇ４１８加压筛选、ＴＰＯ表达稳定性等项指标测试,获得了稳定分泌ＴＰＯ的工程细胞株。     

人IL-18 cDNA克隆及其真核表达质粒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从健康人外周血单核细胞的总ＲＮＡ中扩增出编码白细胞介素１８的全长ｃＤＮＡ,并将此基因定向克隆入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３中,通过对转化子的筛选得到了带有ＩＬ－１８插入片段的阳性克隆,经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道的完全一致。把重组质粒ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－１８分别转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２和鼠肉瘤细胞Ｓ１８０,在ｍＲＮＡ水平检测到ＩＬ－１８的表达,但ＩＬ－１８ 的表达未诱导肿瘤细胞产生ＩＦＮ－γ。     

汉滩病毒S基因及其5‘端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义,为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物,用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ）,用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中,成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体,并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率,目　的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

MMP-7基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达与鉴定

目的：构建MMP-7基因真核重组质粒,检测并鉴定MMP-7在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法：提取宫颈癌组织总RNA,通过基因克隆构建MMP-7基因真核表达重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7,酶切、PCR及基因测序鉴定,用阳离子脂质体介导采用基因转染技术转染人宫颈癌Hela细胞,RT-PCR检测外源基因的表达、间接免疫荧光法检测对表达产物进行鉴定。结果：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7并转染了人宫颈癌Hela细胞,通过RT-PCR可以检测到MMP-7 mRNA在Hela细胞中的表达,经间接免疫荧光反应可检测到明显的阳性反应,而转染空载体组表达阴性。结论：构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7能在Hela细胞中表达,为该蛋白在人子宫癌后续的功能研究奠定了基础。     

靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株Hela后的生物活性?方法:根据NBS1mRNA序列设计合成四对pre- microRNA片段,定向克隆到pcDNA 6.2- GW/ EmGFP-miR真核表达载体上,并将其转染至Hela细胞株中?采用菌落PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时定量PCR分析鉴定重组体对NBS1mRNA表达的干扰效果以确定其生物活性? 结果:构建的四组重组体插入片段的碱基序列完全正确?重组体能干扰Hela细胞NBS1基因的表达,四组重组体NBS1 mRNA表达量分别为: 0.24±0.17 (NBS1mi-1组)?0.12±0.12 (NBS1mi-2组)?0.41±0.97 (NBS1mi-3组)?0.48±0.93 (NBS1mi-4组),其中NBS1mi-2组表达最低? 结论: 构建的四组NBS1 microRNA重组体在Hela细胞株中都具有生物活性, 且NBS1mi-2组的干扰作用最强? 载体构建成功,为应用microRNA靶向NBS1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis Cvirus)全长开放阅读框的质粒pBRTM／HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3．1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3．1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选。大约两周后,获得稳定表达的细胞株。经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达。在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3．1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50％,而转染pcDNA3．1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h。从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用。     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

反义CD151基因转染对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151基因转染对培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法构建携带全长正义和反义CD151的真核表达载体pcDNA3.1-CD151和pcDNA3.1-anti-CD151重组质粒,转染体外培养的VSMCs,以RT-PCR和Western blot方法检测CD151的表达,用Boyden趋化小室方法观察细胞迁移。结果与载体对照组、脂质体对照组和空白对照组3组均值比较,转染48h后,反义CD151组mRNA表达降低58%,蛋白表达降低51%,正义CD151组的VSMCs CD151mRNA表达增加171%,蛋白表达增加133%;趋化迁移的细胞数,反义CD151组为37.9±6.3,正义CD151组为86.5±12.4;载体对照组、脂质体对照组和空白对照组分别为60.3±7.1、61.8±7.6和67.3±9.6。反义CD151组显著低于其余各组(P<0.01),正义CD151组显著高于其余各组(P<0.01)。结论pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151转染,通过抑制CD151的表达,能够显著抑制大鼠VSMCs的迁移。     

过氧化物酶蛋白1 真核表达载体构建及在Hela 细胞的表达与定位

目的:构建过氧化物酶蛋白1(PRDX 1)的真核表达载体,观察其在Hela细胞内表达及定位。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR方法扩增得到小鼠PRDX 1编码序列,酶切后克隆至pcDNA3-myc载体。重组质粒通过PCR、酶切、测序证明构建正确后经脂质体转染Hela细胞,然后利用Western blot和荧光显微镜技术观察该融合蛋白在细胞内表达及定位。结果:经鉴定证明重组质粒构建正确;Western blot实验显示,该质粒能够在Hela细胞中特异表达;免疫荧光试验显示,蛋白产物分布在胞浆和胞核,证明该蛋白在细胞内高表达。结论:成功构建带有myc标签的PRDX 1真核表达载体,该质粒能够在哺乳细胞中特异表达并且外源性PRDX 1蛋白分布在Hela细胞胞浆胞核内,为深入研究PRDX 1蛋白在细胞内相关生物学研究奠定了基础。     

grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系。方法用RT—PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）／grp78并测序鉴定。用构建成功的pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体转染入人宫颈癌HeLa细胞,经G418筛选获得grp78稳定高表达的HeLa细胞系,并用RT—PCR及Western印迹方法鉴定。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体,筛选获得稳定高表达人grp78的HeLa细胞系。结论grp78真核表达载体的成功构建和稳定高表达grpTS的HeLa细胞系的建立为进一步研究grp78的功能奠定了基础。     

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段.将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白.通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性.利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础.