奶牛隐性乳房炎三种致病菌的多重PCR检测方法的建立

为建立快速并能同时检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌3种奶牛隐性乳房炎致病菌的方法,根据无乳链球菌16S rRNA基因、金黄色葡萄球菌NUC耐热基因、绿脓杆菌ETA基因序列并参考文献各合成一对特异性引物,通过对PCR反应各项参数的调整优化,建立多重PCR检测体系,并同时进行灵敏性试验和特异性试验。结果显示:该检测方法可以同时扩增出无乳链球菌270 bp、金黄色葡萄球菌153 bp和绿脓杆菌375 bp的特异性片段以及细菌16S rRNA 1 500 bp的通用片段,而对于其他的6种病原菌只能扩增出1 500 bp的通用片段,具有较强的特异性。三种特异性引物扩增条带与GenBank上的细菌基因序列同源性为99%。增菌培养24 h,该体系对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最低灵敏度分别为8×10⁴、4×10⁴、1.5×10⁵ CFU·mL^-1。本研究建立的检测方法能够完成无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的快速检测,对于生产上奶牛隐性乳房炎的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。     

小麦赤霉病生防菌DZSG23的抗病机制

课题组前期从健康杜仲叶片中分离得到1株内生细菌枯草芽孢杆菌DZSG23,此菌可以较好地防控小麦赤霉病。为明确芽孢杆菌DZSG23在小麦中的定殖与强化抗病机制研究,利用抗生素标记法分析了DZSG23菌体在小麦组织中的定殖情况,采用荧光定量PCR技术检测不同生育期小麦穗部PR-1、AOS、ACOI等基因的表达水平变化。结果表明,DZSG23可在苗期小麦植株和小麦穗表面稳定定殖;DZSG23浇灌接种苗期小麦后的第34天,DZSG23在苗期小麦植株的根、茎和叶中的定殖量分别达到1.437×10⁶ CFU·g^-1、3.285×10³ CFU·g^-1和2.377×10³ CFU·g^-1;DZSG23喷施小麦穗表面15 d后,穗表面菌群密度仍可达7.146×10³ CFU·g^-1。此外,诱导系统抗性(ISR)信号通路研究表明,拮抗菌DZSG23可以诱导PR-1和AOS基因的上调表达,表明拮抗菌DZSG23引入小麦后可诱导小麦的水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)信号通路,增强其抗病性。     

双重RT-RPA法快速检测沙门氏菌及其1类整合酶基因

以重组酶聚合酶扩增法(recombinase polymerase amplification, RPA)为技术基础,建立了一种能单管同时快速鉴定沙门氏菌及其耐药相关1类整合酶基因的双重荧光定量重组酶聚合酶扩增(duplex real-time recombinase polymerase amplification, RT-RPA)方法。该方法以沙门氏菌特异毒力基因fimY和细菌耐药相关1类整合酶基因intI1为靶标序列,设计特异性RPA引物与exo探针,建立双重RT-RPA方法。结果显示,在fimY引物终浓度320 nmol·L^-1,intI1 引物终浓度400 nmol·L^-1,fimY探针终浓度60 nmol·L^-1,intI1探针终浓度100 nmol·L^-1,反应温度37 ℃,反应20 min时,双重RT-RPA扩增效率最高,且特异性好。灵敏度试验显示,沙门氏菌检测灵敏度为1.29×10¹ CFU·mL^-1,intI1检测灵敏度为1.60×10¹ CFU·mL^-1。实际样品检测试验中,前期从生猪养殖场、屠宰场、超市和农贸市场筛选到61株沙门氏菌(2株携带intI1基因)、555株大肠埃希菌(均携带intI1基因),用建立的双重RT-RPA方法对上述菌株进行检测,可以同时鉴定出沙门氏菌及intI1基因。该方法与传统培养方法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)法相比,具有特异性强、灵敏度高、速度快(检测时间20 min)等优点,为快速鉴定携带耐药相关整合酶基因intI1的沙门氏菌提供了准确有效的方法,可为耐药有害微生物的快速鉴定奠定基础。     

泰地罗新注射液体外抑菌试验及对感染副猪嗜血杆菌仔猪的保护作用

【目的】开展了泰地罗新注射液的体外抗菌活性及对仔猪感染副猪嗜血杆菌的保护作用研究。【方法】体外抑菌活性中,采用试管二倍稀释法,以泰拉霉素为对照,测定泰地罗新对副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌的最小抑菌浓度（MIC）;在对仔猪感染副猪嗜血杆菌的保护作用中,选择菌量为1×10 ¹⁰ CFU·mL ^-1的副猪嗜血杆菌细菌悬液0.5 mL·kg ^-1bw作为攻毒剂量,进行腹腔注射,复制病理模型。将泰地罗新以2、4、8 mg·kg ^-1bw 3个剂量,泰拉霉2.5 mg·kg ^-1bw单次肌肉注射,治疗人工感染副猪嗜血杆菌的仔猪;在病死猪病料病原菌分离与鉴定中,挑取分离纯化后的副猪嗜血杆菌菌落进行基因组DNA提取,针对副猪嗜血杆菌16sRNA序列设计1对特异性引物,PCR扩增后检验目的DNA片段碱基序列长度。 【结果】体外抑菌结果显示,泰地罗新注射液对副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌及多杀性巴氏杆菌的MIC分别为0.06—8.00、0.06—8.00、0.25—1.00、2.00—32.00 μg·mL ^-1,MIC₅₀分别为0.5、2.0、4.0、0.5 μg·mL ^-1,MIC₉₀为2、8、16、1 μg·mL ^-1,结果表明,泰地罗新注射液对副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌抑菌效果较强,对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌抑菌效果较弱;DNA目标片段PCR扩增结果显示,PCR扩增目标片段长度均与文献报道中预测条带一致,特异性片段长度为820bp左右,结果表明,病死猪只均死于副猪嗜血杆菌感染;体内治疗试验结果显示,泰地罗新注射液低、中、高剂量组增重分别为（2.5±0.2）、（2.9±0.2）、（2.9±0.3）kg,死亡率分别为40%、0、0,有效率分别为40%、100%、100%,治愈率分别为40%、100%、100%;泰拉霉素注射液组增重为（3.0±0.2）kg,死亡率为10%,有效率为90%,治愈率为80%;感染不给药组增重为（2.1±0.1）kg,死亡率为70%。结果表明,泰地罗新注射液高、中剂量组与泰拉霉素对照药物组无显著性差异（P>0.05）,均能迅速的减轻临床症状,具有显著的治疗效果。泰地罗新低剂量组治疗效果与感染不给药组相当,无显著性差异（P>0.05）。 【结论】泰地罗新注射液按4 mg·kg ^-1bw临床推荐给药剂量,可有效治疗由副猪嗜血杆菌感染引起的猪呼吸道疾病。     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.     

上海市道路绿化带土壤多环芳烃污染特征与健康风险评价

对上海市42个道路绿化带土壤样品的多环芳烃(PAHs)进行检测分析,其浓度范围为227.85~16 461.75 μg·kg^-1,平均值为3 918.92 μg·kg^-1,主要为中高环PAHs,浓度低于国家对建设用地中第二类用地的要求。基于ILCRs模型的健康风险评价表明:道路绿化带的儿童和成人致癌风险值分别为1.66×10^-7~9.34×10^-6和1.00×10^-7~5.63×10^-6,基本在可接受的范围内。儿童PAHs最主要的摄入途径为误食,成人最主要的摄入途径为皮肤接触。     

短稳杆菌对田间杨梅果蝇的防治效果

果蝇是杨梅成熟采摘期最主要的害虫,为科学防控杨梅果蝇,寻求可以在杨梅生产上使用的高效、低毒、低残留安全农药,本研究于2021年5—6月进行了100亿·mL^-1短稳杆菌悬浮剂防治杨梅果蝇田间药效小区试验。试验结果显示,100亿·mL^-1短稳杆菌悬浮剂对杨梅果蝇的防效随浓度增加而上升,600倍液(1.67×10⁷·mL^-1)为适宜剂量,施药后14 d两块试验地点防效分别达87.6%和92.0%,与对照药剂60 g·L^-1乙基多杀菌素悬浮剂 2 000倍液(30 mg·kg^-1)防效无显著性差异。试验结果表明,100亿·mL^-1短稳杆菌悬浮剂具有高效、安全、环境友好等特点,适用于杨梅果园果蝇防治,并能兼治杨梅卷叶蛾、蓑蛾、尺蠖等鳞翅目害虫,可以在实际生产上替代、轮换乙基多杀菌素等药剂使用,延缓杨梅果蝇抗药性的产生。     

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌方法的建立及初步应用

在已经建立的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立胸膜肺炎放线杆菌(App)、多杀性巴氏杆菌(PM)复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增App的342bp和PM的457bp的特异性片段。检测灵敏度分别达9.7pgDNA/1.4×103OCFU和16pgDNA/2.3×103OCFU,用建立的方法检测临床分离的23株可疑菌株,App阳性8株,PM阳性2株,与其它鉴定方法检测结果相符,表明该方法的建立能够对这2种疾病进行临床鉴别诊断。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

植物根尖分生组织传感器的构建及其对尿素传感动力学研究

为探寻植物根尖组织对尿素的传感能力和两者相互作用的动力学规律。以海藻酸钠—淀粉凝胶作固定剂,将玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜的根尖分生组织固定到2片核微孔膜之间,制成“三明治”式尿素传感膜,然后将其固定并密封到玻碳电极上,制成植物根尖分生组织传感器。通过电化学工作站和时间—电流曲线法测定尿素与玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜的根分生组织传感器互作所产生电化学信号的变化。与对照组相比,4种植物根尖分生组织传感器对不同浓度的尿素均呈现明显的函数关系。根分生组织传感器对不同浓度的尿素传感动力学测定结果表明:玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜分别在10^-8~10^-4、10^-16~10^-6、10^-19~10^-10和10^-20~10^-10 mol·L^-1的尿素范围内呈现类似于酶和底物响应的酶促反应特征(联动变构效应)。进一步分析显示:玉米、辣椒、花椰菜、黄瓜和尿素的联动变构常数Ka(类似于酶—底催化动力学的米氏常数Km)分别为:7.197 0×10^-9、4.537 0×10^-16、9.908 5×10^-20和6.462 8×10^-21 mol·L^-1,表明玉米对尿素的传感能力至少比其他3种植物差7个数量级以上。在以尿素为唯一外源氮营养的条件下培养玉米和辣椒,实验结果证明,在低于玉米传感尿素能力下限(1×10^-10 mol·L^-1)时,玉米10~15 d枯黄死亡,而辣椒可以正常生长。证明联动变构常数Ka反映了植物根尖分生组织对尿素的真实传感能力,而且玉米对尿素的传感存在某种程度上的缺陷。     

马铃薯致病疫霉及其拮抗菌的筛选与鉴定

采用组织分离法分离鉴定马铃薯致病疫霉,同时比较3株拮抗菌对马铃薯致病疫霉的抗菌效果,以期获得1株更具有生防潜力的拮抗细菌,并加以鉴定。用涂布分离法得到3株拮抗菌,通过形态学和分子生物学鉴定马铃薯致病疫霉和这3株拮抗菌。同时比较这些拮抗菌对马铃薯致病疫霉游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊直接萌发的抑制效果,分析菌液对马铃薯晚疫病的预防效果。结果鉴定出1株马铃薯致病疫霉PLB-2 Phytophthora infestans和1株具有明显抑制效果的拮抗细菌WZ-502 Brachybacterium sp.。菌株WZ-502的菌液对马铃薯致病疫霉游动孢子释放、孢子囊直接萌发和休止孢萌发有较好的抑制效果。菌株WZ-502菌液浓度为3.65×10⁷ CFU·mL^-1、稀释度为10^-2~10^-3时,对马铃薯致病疫霉的抑制效果均明显,稀释度为10^-3时,马铃薯致病疫霉孢子囊萌发率和释放率均在40%以下。因此,菌株WZ-502对马铃薯致病疫霉抗菌效果显著,具有一定的生防潜力。     

质粒介导的tet(A)突变体对肺炎克雷伯氏菌替加环素耐药的影响

替加环素是治疗多重耐药肺炎克雷伯氏菌感染的为数不多的抗菌药物之一,但替加环素耐药肺炎克雷伯氏菌的出现给临床治疗带来了严重威胁。本实验从临床分离到1株替加环素耐药肺炎克雷伯氏菌,电转化实验获得了一个对替加环素耐药的质粒,功能性分析发现该质粒中的tet(A)基因发生了双移码突变,且药敏实验证实这些突变可单独使替加环素的MIC值增加8倍,米诺环素和四环素的MIC值增加128倍。研究证实,质粒介导的tet(A)突变体可导致肺炎克雷伯氏菌对替加环素耐药,扩宽了对肺炎克雷伯氏菌替加环素耐药机制的认识,并为该类型耐药基因在革兰氏阴性菌中的扩散控制提供了依据。     

无损检测10种植物叶片含水量的通用模型

对植物叶片含水量进行快速、准确和无损检测有助于诊断植物缺水程度。以10种植物叶片为研究对象,自行设计平行板电容传感器,改进电阻测量方法,对叶片电容和电阻进行检测。采用SPSS 19.0软件对测量数据进行组内相关系数分析,验证数据的可靠性。将叶片分成训练集和测试集,用Excel软件对训练集进行回归分析,建立叶片含水量与电容、电阻的拟合模型,并利用拟合模型对测试集叶片含水量进行预测。结果表明,10种植物叶片电容测量值可靠性良好,红叶石楠和杨梅叶片电阻测量值可靠性良好,女贞、无患子、紫荆和桂花叶片电阻测量值可靠性一般,珊瑚树叶片电阻测量值可靠性较差。经Excel回归分析,决定系数R²为0.978 8,调整R²为0.977 4,P=7.85×10^-37,拟合方程为Z=86.0897-628.471X^-1-11.1753Y+117.2954Y·X^-1,模型拟合效果良好。利用该模型对测试集叶片含水量进行预测,与烘干法比较误差值为-2.53%~1.46%。因此,该模型可以作为该10种植物叶片含水量预测的通用模型。     

杨梅污染肺炎克雷伯氏菌的分离及其耐药特征和毒力基因

杨梅在生产与运输过程中易受到病原菌的污染,为分析杨梅中肺炎克雷伯氏菌的携带情况及肺炎克雷伯氏菌的耐药特征和毒力基因,分别从杭州市场和杨梅生产基地采集90份杨梅样品,测定大肠菌群污染状况,使用梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪和16S rRNA测序方法鉴定肺炎克雷伯氏菌,采用VITEK 2阴性菌药敏卡对所获得的肺炎克雷伯氏菌进行耐药表型分析,PCR扩增检测耐药基因和毒力基因。结果表明:90份样品中共有51份样品存在大肠菌群污染,污染率为56.7%,有9株肺炎克雷伯氏菌,检出率为10%,其中8株肺炎克雷伯氏菌聚为一簇。9株肺炎克雷伯氏菌对氨苄西林、头孢唑林和呋喃咀啶均呈不同程度的耐药,尤其是氨苄西林耐药率达88.89%。9株菌株均携带tetA基因,检出blaTEM、gyrA、aadA1和aac(6')-1b耐药基因的阳性率均为88.89%,blaCTX-M、floR、ereA、ermB和mecA等耐药基因未检出,毒力基因wcaG、magA、rmpA和菌素未检出。综上,杨梅中存在一定的肺炎克雷伯氏菌污染,但这些菌株未携带wcaG、magA、rmpA等毒力基因和菌素。     

金柑CDDP-PCR反应体系优化研究

构建优化金柑CDDP-PCR反应体系并筛选适用于金柑CDDP-PCR分析的理想引物,为利用CDDP标记技术辅助种质鉴定以及分子育种等提供参考依据。以金柑基因组DNA为模板,采用正交优化试验设计方案,对dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度设计5因素4水平试验,采用极差分析法、方差分析法和Duncan多重比较法对试验结果进行分析。结果表明:利用供试的5个金柑品种验证试验效果,21条CDDP通用引物均可扩增出多态性条带。最佳反应体系为:dNTPs浓度为0.15 mmol·L^-1,引物浓度为1.0 μmol·L^-1,模板DNA用量为120 ng,Mg²⁺浓度为1.5 mmol·L^-1,Taq DNA聚合酶浓度为0.25 U,剩余体积用ddH₂O补足至20 μL。各因素对反应体系影响从大到小依次为dNTPs>引物>模板DNA>Mg²⁺>Taq DNA聚合酶。     

纳米碳与枯草菌对黄瓜幼苗生长及土壤环境的影响

为筛选适宜黄瓜苗期生长的枯草芽孢杆菌浓度,以黄瓜幼苗为材料,设置纳米碳溶胶和枯草芽孢杆菌浓度双因素试验,纳米碳溶胶稀释倍数设0、350、650倍,枯草芽孢杆菌浓度为0、8×10⁷、1.6×10⁸ CFU·mL^-1,分析枯草芽孢杆菌和纳米碳溶胶对黄瓜苗期长势、根系生长状况和土壤肥力的影响。结果表明,适宜浓度的枯草芽孢杆菌和纳米碳溶胶能够显著增强黄瓜幼苗的地上、地下部分生长,改善土壤状况。单施情况下,1.6×10⁸ CFU·mL^-1枯草芽孢杆菌处理可以促进根系生长,显著降低土壤电导率(EC值)的同时提升土壤P含量,增强土壤酶活性,增加细菌、放线菌数量;650倍纳米碳溶胶处理可以显著促进植株叶片生长,提升土壤有机质含量和蔗糖酶活性,土壤放线菌数量增加57.36%。8×10⁷ CFU·mL^-1枯草芽孢杆菌与650倍纳米碳溶胶共处理使株高相对生长率提高6.51%,显著促进根系生长,根系干质量、鲜质量、表面积、直径和体积均为处理中最高,比未添加菌剂与纳米碳的处理分别提高56.63%、57.14%、66.15%、56.55%、21.94%,降低土壤EC值,土壤中细菌数量是未添加菌剂与纳米碳的1.85倍,综合表现最优。