HaCaT细胞中FUT4表达与其启动子区甲基化的相关性分析

岩藻糖基转移酶Ⅳ(Fucosyltransferase Ⅳ,FUT4)在正常细胞中表达量很低,但其低表达的调控机制以及是否受其启动子甲基化调控并不十分清楚。文章采用Western blot、免疫荧光和Real-time PCR的方法检测正常人永生化表皮细胞系HaCaT细胞FUT4的表达,观察DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC处理对FUT4表达的影响。应用甲基化特异性PCR方法分析HaCaT细胞中FUT4启动子甲基化状态。结果表明,HaCaT细胞中FUT4的表达水平明显低于人表皮鳞癌细胞A431和SCC12。5 μmol/L的5-aza-dC处理72 h的HaCaT细胞,其FUT4 mRNA水平明显升高,并且与未经5-aza-dC处理的对照组相比,U引物扩增检测到的产物量增加,M 引物扩增检测到的产物量明显减少。这些结果表明,HaCaT细胞中FUT4的低表达可能与其启动子区CpG岛甲基化有关。     

DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的：探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2＇-脱氧胞嘧啶（5-Aza-CdR）处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果：DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论：抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞TSLC1基因甲基化及其表达的影响

目的：检测人宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因甲基化的状况,研究在人宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中TSLC1基因甲基化的变化情况,探讨肿瘤细胞凋亡与抑癌基因甲基化的相关性,并进一步证实天花粉蛋白（TCS）去甲基化作用是否存在普遍性,以促进天花粉蛋白的临床应用。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）法检测人宫颈癌HeLa细胞及其凋亡过程中TSLC1基因甲基化的状况;采用实时定量RT-PCR技术检测TCS处理前、后HeLa细胞TSLC1基因表达的变化。结果：肿瘤抑制基因TSLC1在人宫颈癌HeLa细胞中呈高度甲基化状态,经40μg／mL TCS处理48h后,TSLC1基因甲基化程度明显降低;RT-PCR检测结果显示,TCS处理组HeLa细胞中TSLC1 mRNA的表达量高于未处理组,提示TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化是导致其低表达的重要机制。结论：肿瘤抑制基因TSLC1启动子甲基化在人宫颈癌癌变过程中可能是一种重要的分子调控机制;人宫颈癌HeLa细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化之间可能存在某些密切的相关性;TCS对肿瘤抑制基因TSLC1有一定的去甲基化作用。     

UPF1甲基化和miR-744-5p/CCND1在甲状腺乳头状癌中的作用机制研究

摘要 目的：探讨UPF1甲基化和miR-744-5p/CCND1在甲状腺乳头状癌中的作用机制研究。方法：将人甲状腺乳头状癌细胞株TCP-1和正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori-3分别用去甲基化试剂5-Aza-CdR进行干预,分别在干预前后采用甲基化特异性PCR技术检测UPF1基因甲基化变化,采用Western-Blotting 检测干预UPF1、DNMT1、miR-744-5p、CCND1蛋白相对表达,采用transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果：PCR扩增显示,UPF1基因在Nthy-ori-3组仅出现非甲基化引物扩增条带（U条带）,在TCP-1组仅出现甲基化引物扩增条带（M条带）。经5-Aza-Cdr作用后,UPF1基因甲基化扩增条带减少,甲基化表达降低。各组UPF1、DNMT1、miR-744-5p、CCND1蛋白相对表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。与Nthy-ori-3组比较,TCP-1组DNMT1、UPF1蛋白相对表达明显提高,miR-744-5p、CCND1蛋白相对表达明显降低（P＜0.05）;与TCP-1组比较,TCP-1干预组DNMT1、UPF1蛋白相对表达明显降低,miR-744-5p、CCND1蛋白相对表达明显提高（P＜0.05）。与TCP-1组比较,TCP-1干预组细胞侵袭、迁移数量明显减少（P＜0.05）。结论：UPF1甲基化存在于甲状腺乳头状癌中,UPF1基因甲基化的表达缺失可能抑制miR-744-5p/CCND1轴,在甲状腺乳头状癌发生发展中发挥关键作用。     

RG108对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及RASSF1A基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂RG108对人肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡以及对RASSF1A（Ras as-sociation domain proteinfamily1）基因启动子区域甲基化状态、表达的影响。方法用20μmol/L的RG108对A549细胞进行化学干预72h,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术检测细胞周期以及凋亡情况;RT-PCR观察RASSF1A基因mRNA水平变化;Western blot检测RASSF1A蛋白的表达;甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测RASSF1A基因启动子区域甲基化状态的改变。结果经RG108干预72h后,A549细胞的抑制率为17.2±0.43%,细胞周期阻滞于G0/G1期,并引起细胞凋亡。RT-PCR和Western blot结果显示在干预组细胞中分别出现RASSF1A基因的DNA条带（329bp）和蛋白质条带（39kD）,而对照组中无相应条带出现。RASSF1A基因启动子区域由甲基化状态转变为非甲基化状态。结论RG108可使RASSF1A基因启动子区域去甲基化,并通过该机制诱导RASSF1A基因在人肺腺癌细胞株A549中表达。     

肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究

目的:分析肝细胞癌组织中FHIT基因启动子甲基化状态及其与FHIT基因表达和肝细胞癌临床病理特征的关系。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析肝细胞癌组织和癌旁正常肝脏组织中FHIT基因启动子甲基化状况;应用RT-PCT和Western免疫印迹方法检测FHIT基因mRNA和蛋白的表达情况;统计学分析FHIT基因启动子甲基化与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果:MSP分析结果表明肝细胞癌组织中FHIT基因甲基化率(60.8%)显著高于癌旁正常组织中FHIT基因甲基化(16.2%;x2=31.071,P=0.000)。同时我们还发现:发生完全或者部分甲基化的肝细胞癌组织或者癌旁正常肝组织中FHIT基因mRNA和蛋白表达水平显著降低。FHIT基因启动子甲基化和肝细胞癌患者的临床分期和肝外转移情况密切相关(P=0.006和0.049),而与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。结论:FHIT基因甲基化是导致FHIT基因在肝细胞癌中失活的一个重要因素,与肝细胞癌的发生密切相关,有望成为肝细胞癌早期诊断的分子检测标志物和分子治疗新靶点。     

DLC-1 基因在MCF-7 人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的:探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果:DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论:抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法

利用组织特异性分子标志物启动子调控Cre重组酶,研制了6种在不同组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠.这些转基因小鼠的基因型鉴定均使用设计在Cre基因编码区的通用引物.为了特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶的转基因小鼠,在大鼠胰岛素RIP启动子上和Cre基因上设计1对引物进行PCR扩增,并通过凝胶电泳进行分析.PCR结果显示,设计在Cre基因上的通用引物可以从6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增获得480 bp产物;利用本研究设计的特异性引物可以从胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增200 bp的目的条带.这一结果表明,利用特异性引物进行PCR反应,可有效地将胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠与其他多种组织的Cm重组酶转基因小鼠鉴别开来.     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

Specific 50'CpG island methylation signatures of FHIT and p16 genes and their potential diagnostic relevance in Indian breast cancer patients

Even after tremendous molecular studies, early detection,more accurate and sensitive diagnosis, and prognosis of breast cancer appear to be a riddle so far. To stab the enigma, this study is designed to envisage DNA methylation signatures as cancer-specific and stage-specific biomarkers in Indian patients. Rigorous review of scattered scientific reports on aberrant DNA methylation helped us to select and analyze a potential tumor suppressor gene pair (FHIT and p16 genes) in breast cancer patients. Methylation signatures from 232 primary sporadic breast cancer patients were pinpointed by methylation-specific PCR (MSP). To increase the sensitivity, we combined both MSP and expression studies (RT-PCR and Northern blotting) in a reproducible manner. Statistical analysis illustrated that hypermethylation of FHIT gene ( p < 0.0001) and p16 gene ( p=0.04) may be used as a potential diagnostic marker to diagnose the early and locally advanced stages of breast cancer. Additionally, the study authenticates the dependency of methylation and expressional loss of p16 gene on FHIT gene silencing. This observation not only describes the severity of disease when both genes are silenced but also drives to speculate the molecular cross talk between two genes or genetic pathways dictated by them separately.     

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。