不同产地广藿香的RAPD分析

目的研究不同产地广藿香遗传上的差异。方法采用46种引物进行RAPD分析,筛选出可鉴别广藿香RAPD图谱引物6条,发现引物S358能较好地反映不同产地广藿香多态性微小的差别,不同产地的广藿香有三条相同的扩增带,并且S358、S359、S443能将石牌广藿香与同科属其他药材区分开来。结果将不同产地广藿香进行聚类分析,高要的两个广藿香为一类,湛江和海南、石牌的四个广藿香聚为一类;采芝林的一个样品与附院样品聚为一类,而来自清平药材市场的样品单独聚为一类。结论RAPD分析可以作为不同产地广藿香的鉴定依据之一。     

半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析

目的分析半夏多倍体复合体DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。方法应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,采用34对引物进行选择性扩增。结果扩增共得到7708条带,其中5636条带为甲基化多态性带在半夏7倍、8倍、9倍、10倍体值株间DNA甲基化水平变化不大。总扩增位点甲基化水平在54%～58%,全甲基化率为24.1%～24.3%,高倍性植株甲基化程序相应比较高。除甲基化水平稍有变化外,半夏不同倍性株间的DNA甲基化模式也形式各异,检测到的带型分为两大类(和型)。其中,不同倍性间DNA甲基化状态保持不变的位点占52.5%,归为型;少部分检测位点(占47.5%,归为型)的DNA甲基化模式在不同倍性间存在显著差异。结论半夏多倍体复合体各倍性植株间存在大量的胞嘧啶甲基化变异且整体甲基化水平较高。     

DNA条形码及ISSR技术对广藿香种质资源的分析

目的采用DNA条形码技术和分子标记技术研究不同产地广藿香的遗传多样性,探讨从基因水平区分不同产地广藿香的方法。方法分别采用DNA条形码技术和ISSR分子标记技术对不同产地的广藿香进行分析。DNA条形码——PCR扩增ITS2和psbA-trnH条形码序列,产物纯化后测序,采用软件CLUSTALX 1.81和MEGA 6.06对序列进行对比分析。ISSR分子标记——采用60条ISSR引物进行试验,筛选出条带清晰、多态性好的ISSR引物进行PCR、电泳及聚类分析。结果 DNA条形码技术分析结果显示不同产地广藿香差异很小;ISSR分子标记技术分析结果显示肇庆和阳春的广藿香亲缘关系较近,湛江广藿香与其他两个产地亲缘关系均较远。结论 ISSR分子标记技术可作为鉴别不同产地广藿香的依据之一。     

广藿香化学诱变植株SRAP遗传特性及质量研究

目的：研究广藿香化学诱变植株的遗传特性和品质差异。方法：以前期经氟乐灵、亚硝酸钠及亚硫酸钠诱变后筛选出的变异植株为材料,对其基因组DNA进行相关序列扩增多态性（SRAP）分析,并测定其主要有效成分含量。结果：10对SRAP引物扩增的总位点数为235个,其位点数为16～29个,而多态位点数为220个,平均多态性百分比达86.96%;广藿香变异植株的遗传相似系数为0.445～0.938,其变异程度大于不同产地种群间的变异程度;当遗传相似系数为0.55时,变异程度较大的植株N1a、N1b、N1c、S4c、S4d、S6c聚为一类,其他与CK聚为另一类。变异植株主要化学成分百秋李醇及广藿香酮含量与CK差异均有统计学意义（P<0.05）,其中变异植株F1、F2a、F4a、F4d、F4e、F6e、F8i、N2c、N2d的广藿香酮明显升高,且高于百秋李醇的含量,由“醇型”广藿香转变为“酮型”广藿香;变异植株F4c、F6d、F8j、N1a、N1b、N1c、S3b、S4c、S4d、S6b、S6c的百秋李醇或广藿香酮含量均显著高于CK。结论：化学诱变是广藿香新品种选育的有效途径,可提高其遗传多态性,影...     

不同栽培居群广藿香的种内遗传多样性研究

目的:探讨广藿香不同栽培居群的遗传多样性和种内分化水平,寻找有效地鉴定不同居群广藿香DNA指纹特征方法。方法:从80个随机引物中筛选出14个具较高多态性检测能力的引物。用这14个随机引物对5个栽培居群的广藿香进行了的分析,对得出的结果应用PopGen32软件进行计算和聚类分析。结果:实验测出84个位点,其中单态位点17个,占20.24%;多态位点67个,占79.76%。分析结果表明,同一种内不同栽培居群间存在明显的遗传分化。结论:应用RAPD选择特定引物对广藿香遗传多样性的分析及不同居群的鉴定是可行的。RAPD技术为广藿香遗传种质资源的鉴定和分类提供了新的途径。     

广藿香挥发油气相色谱指纹图谱再研究

目的:建立广藿香挥发油的特征指纹图谱,用于广藿香的品质控制及产地鉴别.方法:采用GC法对高要、石牌、吴川、遂溪、雷州及海南万年产广藿香挥发油进行GC图谱的比较分析.结果:以11个共有峰为评价指标,GC分析色谱条件的精密度、稳定性、重复性良好;同产地、不同采收期广藿香的主成分基本相同,但含量有差异;不同产地的广藿香其各组分的含量有较大的差异.结论:以11个共有峰作为广藿香挥发油特有的指纹图谱,以广藿香酮与广藿香醇的峰面积比值作为鉴别不同产地的广藿香的指标参数,建立了可用于广藿香道地性鉴别及品质评价的气相色谱指纹图谱标准.     

花叶型与艾叶型乌头叶片基因组DNA甲基化修饰的MSAP分析

建立乌头叶片DNA甲基化MSAP分析方法,并对不同形状的乌头叶片DNA甲基化修饰位点进行MSAP分析。以花叶型、艾叶型乌头不同部位叶片为实验材料,考察乌头叶片MSAP双酶切反应时间,筛选适宜的选择性扩增引物,并通过计算6%丙烯酰胺凝胶电泳图泳道和条带统计分析叶片甲基化修饰差异。结果 150 ng乌头叶片DNA MSAP双酶切反应体系在37℃条件下,酶切16 h较充分;使用25对筛选出的适宜性引物进行乌头基因组的MSAP选择性扩增,总共获得273个电泳条带,其中无甲基化或单链内甲基化228条,双链内甲基化条带27条,单链外甲基化条带18条,总甲基化率达16.48%;花叶型与艾叶型乌头总甲基化率稍有差异,分别为15.36%,14.34%,并各自获得8条、6条基因组甲基化修饰差异的核苷酸片段,占其总条带数的3.00%,2.26%。通过研究可为乌头植株的分子鉴定、良种选育与栽培,以及乌头的遗传演化等提供新思路。     

连作对穿心莲基因组DNA甲基化的影响

目的:探究连作条件下穿心莲基因组DNA的甲基化水平及模式变化情况。方法:结合甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术和液相色谱-质谱(LC-MS/MS)法对3个连作年限(0,1,2年)穿心莲基因组DNA的甲基化水平及模式进行分析。结果:LC-MS/MS测定的连作0~2年穿心莲基因组DNA甲基化水平为13.91%,12.72%,10.26%,MSAP测定的结果则为10.16%,9.64%,8.98%,两者均表明穿心莲基因组DNA的甲基化水平与连作年限呈现负相关,即DNA甲基化水平随着连作时间的延长而逐渐下降。MSAP技术对DNA甲基化模式分析也显示,穿心莲基因组DNA的CCGG位点在连作过程中主要发生了去甲基化。结论:连作条件下,穿心莲基因组DNA的甲基化水平和模式发生改变并以此来响应连作胁迫。     

四倍体菘蓝基因组DNA甲基化的甲基化敏感扩增多态性分析

目的 分析四倍体菘蓝Isatis indigotica基因组DNA甲基化水平和模式.方法 采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)方法,对四倍体菘蓝基因组DNA的甲基化水平和模式进行分析.结果 筛选36对MSAP选择性引物进行扩增,共得到1733条清晰的条带.二倍体菘蓝基因组胞嘧啶甲基化水平为24.05％,四倍体菘蓝基因组胞嘧啶甲基化水平为23.70％.检测到83个(4.86％) CCGG位点在四倍体菘蓝基因组中发生了DNA甲基化模式的改变,其中37个(2.13％)位点发生了超甲基化,36个(2.08％)位点发生了去甲基化.结论 二倍体和四倍体菘蓝在CCGG位点上存在胞嘧啶甲基化状态的改变.     

温度对菘蓝基因组DNA甲基化的影响

目的:分析高温对菘蓝基因组DNA甲基化模式的影响。方法:采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitiveamplification polymorphism,MSAP)方法,筛选36对选择性引物进行扩增。结果:扩增共得到1 612条清晰的带纹,共检测到82(5.1%)个CCGG位点在高温胁迫后发生了甲基化状态的改变,其中58(3.6%)个位点发生了超甲基化,24(1.5%)个位点发生了去甲基化。结论:温度是调节菘蓝基因组DNA甲基化模式的一个重要环境因子。     

广藿香八氢番茄红素脱氢酶PcPDS1基因克隆和序列分析

目的 为阐明广藿香类胡萝卜素代谢途径,克隆了广藿香Pogostemon cablin八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因,并对其进行相关生物信息学分析.方法 搜索本课题组建立的广藿香转录组数据库,获得PDS基因全长序列,并设计全长引物进行PCR验证;利用生物信息学软件对PDS基因进行生物信息学分析.结果 本研究获得的广藿香PDS基因命名为PcPDS1(GenBank登录号为KC854409),该基因全长1 960个碱基,编码569个氨基酸.基于生物信息软件分析了PcPDS1基因编码蛋白的理化特性.系统进化树分析结果表明,PcPDS1基因与黄龙胆Gentiana lutea的PDS序列同源性最高,与烟草Nicotiana tabacum、番薯Ipomoea batatas次之,与自然进化关系保持一致.结论 成功克隆、分析了广藿香PcPDS1基因.     

基于超滤和蒸汽渗透膜法广藿香挥发油分离研究

目的在比较超滤膜和蒸汽渗透膜对广藿香挥发油提取效率的基础上,提出膜法中药挥发油提取的适用范围,进而对工艺设计中的关键技术问题进行解析。方法选取聚偏氟乙烯(PVDF)膜材料,分别采用超滤、蒸汽渗透膜技术对广藿香挥发油进行提取分离;从挥发油收率、膜分离前后挥发油理化性质等方面,综合分析比较超滤、蒸汽渗透膜技术对广藿香挥发油的提取效率。对膜法中药挥发油的提取工艺进行比较分析,提出新型工艺设计的关键技术参数。结果超滤技术和蒸汽渗透技术对广藿香挥发油的收率分别为84.87%、78.46%;从化学组成看,PVDF膜在蒸汽渗透膜分离过程中对广藿香挥发油中醇、酮类成分的亲和透过具有一定的影响;从红外光谱检测结果看,PVDF膜在蒸汽渗透膜分离过程中所透过油在3600~3650cm-1的官能团峰强度显著减弱,即PVDF膜在蒸汽渗透膜分离过程中截留了挥发油中的醇、酮类成分,对醇、酮类成分的透过具有显著性影响。结论超滤法和蒸汽渗透法均为较好的广藿香挥发油富集方法,相比于超滤,蒸汽渗透膜技术对广藿香挥发油具有更好的分离效果。而超滤法趋向于广藿香挥发油中醇酚等含氧基团类成分的富集,蒸汽渗透法更趋向于烯类成分的富集。膜技术作为一种新型分离技术,其分离工艺的设计和优化对分离体系具有重要影响。     

川藿香与广藿香挥发油化学成分GC-MS对比分析

目的: 对比分析川藿香和广藿香挥发油化学成分。方法: 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,并运用GC-MS进行分离测定,结合质谱库检索技术对化合物进行结构鉴定,应用色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。结果: 川藿香挥发油中分离出88种成分,鉴定出45种化学成分,占总含量的93.81%;广藿香中分离出92个成分,鉴定出22个化学成分,占总量的85.80%。结论: 采用GC-MS联用技术对川藿香和广藿香挥发油化学成分进行对比分析,二者差异较大。     

基于Heracles Neo超快速气相电子鼻对广藿香饮片的快速鉴别及气味指纹图谱研究

目的 通过Heracles Neo超快速气相电子鼻技术,建立广藿香饮片快速鉴别方法,建立专属性特征性强的广藿香饮片气味指纹图谱.方法 采用Heracles Neo超快速气相电子鼻对广藿香饮片及黑龙江、四川和湖南3个产地的藿香饮片样品进行气味分析,根据获取的气味色谱信息,结合Kovats保留指数及Arochembase数...     

广藿香内生真菌类群分析及其抗菌活性研究

从广藿香的根、茎、叶中共分离得到72株内生真菌,根据ITS序列分析鉴定为25属40个种,其中拟茎点霉属Phomopsis、刺盘孢属Colletotrichum、镰刀菌属Fusarium为优势种群;广藿香内生真菌的分布存在明显的组织特异性,以茎中内生真菌的分布最多,占分离菌株总数的78%;活性测试结果显示共有15个属34株内生真菌至少对1种供试菌具有抗菌活性。结果表明广藿香内生真菌多样性丰富,部分菌株具有明显的抑菌活性,值得进一步深入研究。     

广藿香PcHAD基因克隆及其参与广藿香醇生物合成功能分析

目的 从广藿香Pogostemon cablin中克隆HAD(haloacid dehalogenase)超级家族蛋白水解酶基因PcHAD,验证其编码蛋白与广藿香醇合酶（patchoulol synthase,Pc PTS）蛋白互作,探究其参与调控广藿香醇生物合成的作用。方法 从广藿香转录组数据中,筛选出一条具有完整编码区并且包含HAD-like结构域的HAD基因序列（Pc HAD）,并对该基因进行克隆和生物信息学分析。利用q RT-PCR对Pc HAD的表达模式进行分析。利用酵母双杂交实验进一步验证Pc HAD与广藿香Pc PTS蛋白的互作情况。通过瞬时过表达Pc HAD,分析其对广藿香醇甲羟戊酸合成途径（mevalonatepathway,MVA）相关基因的表达以及对广藿香醇含量的影响。结果 从广藿香中克隆得到HAD-like基因Pc HAD,其开放阅读框为1149 bp,编码蛋白长度为382个氨基酸,蛋白相对分子质量为43 000,且为不稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位结果表明该蛋白定位于叶绿体。酵母双杂交实验结果表明Pc HAD完整蛋白能与Pc PTS完整蛋白互作,且Pc HADN...     

外源水杨酸对盐胁迫下广藿香种子萌发和幼苗生长的影响

目的研究外源水杨酸(SA)对盐(NaCl)胁迫下广藿香Pogostemon cablin种子萌发和幼苗生长的影响,并筛选缓解盐胁迫的SA最适浓度。方法用50 mmol/L NaCl溶液模拟盐胁迫,采用纸上发芽,研究不同浓度梯度外源SA处理对盐胁迫下广藿香种子的发芽势(GE)、发芽率(GR)、发芽指数(GI)、活力指数(VI)、苗长(SL)、根长(RL)、苗鲜质量(SFW)、苗干质量(SDW)、叶绿素量(SPAD值)、可溶性蛋白质(SP)量和丙二醛(MDA)量的变化,并对各指标进行相对盐害率分析。结果盐胁迫显著抑制了广藿香种子萌发和幼苗生长。0.10和0.25 mmol/L SA处理均可有效缓解广藿香盐害程度,而0.50 mmol/L SA处理却加剧了盐害程度。综合考虑各项指标,0.25 mmol/L SA处理的盐害缓解效果最好,与盐对照相比,GE、GR、GI、VI、SL、RL、SFW、SDW、SPAD值和SP量分别显著提高46.02%、27.45%、30.16%、92.63%、39.80%、47.94%、26.48%、18.85%、15.94%和14.70%,且叶片MDA量显著降低18.35%。结论一定浓度范围的SA可明显缓解盐胁迫对广藿香种子萌发和幼苗生长的抑制作用,提高广藿香种子的萌发能力和幼苗对环境的适应能力,以0.25mmol/L SA效果最佳,但过高质量浓度SA处理会加剧盐胁迫对广藿香的不利影响。