拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析

长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合,包含黄素,产生H_2O_2的长链脂肪醇氧化酶.在拟南芥基因组中包含4个FAO同源基因.然而,拟南芥FAO在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知.本研究中,我们分析了拟南芥AtFAO3在植物防卫病原细菌Pseudomonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst DC3000)中的作用.拟南芥原生质体细胞瞬时表达AtFAO3偶联GFP融合蛋白表明,AtFAO3定位于细胞膜.与野生型植株相比,拟南芥AtFAO3基因T-DNA插入突变体Atfao3在正常条件叶片中H_2O_2含量下降,在氧胁迫或生物胁迫下积累活性氧含量减少.接种病原细菌Pst DC3000后,与野生型植株相比,Atfao3突变体体内细菌繁殖数量增加,叶片病害症状加重,防卫相关基因PR1、PR2和PAL表达减弱.我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明,AtFAO3在植物对病原细菌防卫中起重要作用.     

CRISPR/Cas9技术在获取双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3 与sb6 的功能,需要创制这2 个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对拟南芥Col-0 中的sb3、sb6 基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer 测序验证,共获得10 株T0代转基因植株,其中5 株在目标片段上没有发生编辑;另5 株在sb3 基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6 基因的目标序列上只有2 株发生了编辑。至此成功获得了sb3 与sb6 基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础     

AtGHR1介导拟南芥对LPS先天免疫反应的分子机制研究

植物先天免疫的分子基础是位于植物细胞膜的受体蛋白对病原菌特有分子模式的特异识别。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的核心组分,可以被动物细胞质膜的TLR4复合物识别。为了探索植物细胞识别LPS的受体,用动物TLR4氨基酸序列比对拟南芥蛋白数据库,发现拟南芥AtGHR1氨基酸序列同TLR4高度类似。利用β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因和绿色荧光蛋白标记技术,发现AtGHR1在叶片和根尖中强表达,其编码蛋白位于细胞质膜。在AtGHR1基因缺失突变体atghr1叶子上,含有LPS的病原菌Pst DC3000繁殖的数量显著高于在拟南芥野生植物叶子上的数量,说明atghr1比野生植物更感病。LPS处理诱导H_2O_2和细胞质Ca~(2+)浓度的升高,但是在拟南芥野生植物和突变体atghr1幼苗之间没有显著性区别。在atghr1突变体保卫细胞内,利用NO荧光探针对LPS诱导的NO爆发进行实时检测,发现NO依赖的荧光信号显著低于野生植物。转录组芯片研究发现,在表达水平上受LPS调控的基因中,有部分依赖AtGHR1的存在。这些数据表明,AtGHR1是拟南芥感应LPS必需基因,部分参与拟南芥对LPS的先天免疫反应;在AtGHR1以外,还有其他未知基因参与这一过程。     

利用酵母单杂交筛选拟南芥AtSTK基因表达调控蛋白的研究

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。     

拟南芥swn突变体耐盐性的初步分析

SWN (Swinger)蛋白是多梳抑制复合体2 (polycomb repressive complex2, PRC2)结构的核心成分之一,为了研究SWN在拟南芥中耐盐胁迫方面的作用,我们分析了拟南芥突变体swn与野生型之间转录组水平的基因表达差异,高盐胁迫下的萌发实验,以及与盐胁迫响应基因RD20 (Responsive to desiccation 20)、SOS1 (Salt overly sensitive)和MAPK6 (Mitogen-activated protein kinase)的表达。结果显示,GO富集分析表达上调的基因,共富集到20个GO通路,其中响应盐胁迫通路(Respond to salt stress)富集程度较高;在高盐胁迫下,swn表现出比野生型更高的萌发率,幼苗生长情况也优于野生型;盐胁迫响应基因RD20、SOS1和MAPK6表达量也更高。本研究表明,swn突变体对盐的耐受性强于野生型,SWN基因在拟南芥抗盐过程中发挥负调控作用。     

茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析

植物己糖激酶是双功能蛋白,具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。前期研究中,我们从茶树中克隆获得4个己糖激酶基因,其中CsHXK2基因编码492个氨基酸残基,与拟南芥AtHXK3、番茄LeHXK4归为Type A类HXKs。利用RT-PCR技术,克隆获得长度为2029bp的CsHXK2基因启动子。CsHXK2基因可能受到光照、低温、病原菌、糖和多种激素等信号的调控,且可能特异性表达于叶、花、种子、根系、腋芽等组织。CsHXK2蛋白定位于叶绿体内。酵母突变体功能互补试验表明,去除叶绿体转运信号肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶树组织特异性表达分析显示,CsHXK2基因在根和茎中表达量最高,而在老叶中表达量最低。CsHXK2基因的表达受低温胁迫而显著下调,经炭疽菌侵染的茶树叶片内CsHXK2基因的表达也受到显著抑制,而外源赤霉素(GA_3)处理的茶树叶片内CsHXK2基因表达显著上调。本研究结果表明,CsHXK2基因在茶树的生长发育过程和逆境胁迫响应中发挥重要的调控作用。     

红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥

WRKY转录因子在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。本研究根据红麻转录组unigene序列(CL3883.Contig4),设计引物进行PCR扩增,经sanger测序获得全长为957 bp的HcWRKY71基因cDNA序列。该基因开放读码框为957 bp,编码1个含有318个氨基酸的蛋白,具有1个WRKY功能保守结构域,属于II类WRKY转录因子。在盐胁迫下,HcWRKY71基因表达量随NaCl溶液浓度升高而增加;在干旱胁迫下,HcWRKY71基因表达量随干旱胁迫时间的增加呈现先下降再上升然后再下降的趋势;在重金属镉胁迫下,HcWRKY71基因表达量随CdCl2溶液浓度的增加而降低。表明该基因表达受盐、干旱和重金属镉胁迫的诱导。利用农杆菌介导花序浸染法将该基因转化拟南芥发现,HcWRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性,这为进一步研究HcWRKY71基因的耐逆机制奠定了坚实的基础。     

板栗CmWRKY基因的克隆、序列分析与原核表达

为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。     

拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作蛋白的筛选与分析

前期研究中从拟南芥突变体库中筛选获得一株对灰霉病菌侵染表现为感病的突变体。利用TAIL-PCR等技术克隆获得拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22。为了进一步明确T1N6_22在拟南芥抗灰霉病过程中的调控机制,利用酵母双杂交技术(Y2H),以构建成功的p AS1/T1N6_22蛋白为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库。通过酵母双杂交筛选,共获得28个酵母克隆。利用T1N6_2基因特异性引物鉴定酵母阳性克隆,并进行测序。共获得了4个可能与T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析发现,AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分别为核小体装配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸还原酶和硫胺二磷酸盐结合折叠超家族蛋白,分别参与到核糖体装配、泛酸盐合成、植物代谢等过程中。研究结果为确定T1N6_22蛋白的互作蛋白,阐明其调控拟南芥抗灰霉病的分子机制奠定了基础。     

StEFR1正调控马铃薯对晚疫病的抗性

马铃薯晚疫病是毁灭性卵菌病害,对我国乃至全球的农业生产造成巨大的经济损失。本试验结合生物信息学分析、表达模式和功能验证,分析了LRR-RLK家族成员StEFR1调控晚疫病抗性的作用和潜在的调控机制。进化分析表明, StEFR1与拟南芥中功能已知的AtEFR序列相似度为53.9%。接种晚疫病菌3 d和elf18处理3 h,‘大西洋’离体叶片中StEFR1的表达分别上调至对照的1.87倍和2.31倍。瞬时过表达StEFR1的叶片受到晚疫病菌侵染时抗性增强,表现在叶片病斑面积较对照减小,而叶片细胞活性较对照增强。此外,与野生型相比,过表达StEFR1的叶片中3个PTI标记基因、SA和JA信号通路相关基因差异表达,且呈不同程度的显著上调,而ET信号通路相关基因的表达量无明显变化。综上所述, StEFR1参与晚疫病菌诱导的PTI抗性,且调控SA和JA激素信号相关基因的表达,对晚疫病起正调控作用。本文为深入研究StEFR1调控晚疫病免疫反应的分子机制奠定了基础,并为晚疫病分子育种研究提供重要参考。     

拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT10上游非编码区,并与pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体pNUDT10P-GUS,采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3.5~4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT10启动子,该启动子为组成型表达的启动子,并且病原菌Pst.DC3000及Pst.DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

拟南芥U-box蛋白的研究进展

泛素-26s蛋白酶体途径（ubiquitin-26s proteosome pathway,UPP）是真核生物体内一种高度选择性的蛋白降解途径。U—box蛋白是该途径中决定底物特异性的一种泛素连接酶E3。U—box结构域大约由70个氨基酸残基构成,在酵母、植物和动物等真核生物中高度保守。植物U-box蛋白（plant U—box protein,PUB）的数目远多于其他生物,在植物的生长发育过程中起着重要作用。目前在拟南芥中已发现60多个PUB蛋白（Arabidopsis plant U-box protein,AtPUB）,成为近年来受到较多关注的一类蛋白。本文根据蛋白的结构特征和系统进化树比较,将61种AtPUB蛋白分为7大类。同时,对已报道AtPUB蛋白的功能进行了综述并提出了研究展望。     

甜菜应答盐胁迫PUB基因的生物信息学分析

旨在为研究甜菜U-box型E3泛素连接酶提供理论基础。以甜菜T710-Mu品系为试验材料,前期通过转录组数据获得在盐胁迫下差异表达的甜菜PUB基因(plant U-box gene),利用生物信息学的方法对这些PUB基因进行分析,主要包括理化性质分析、染色体定位分析、基因序列分析、结构域分析、家族分类分析以及互作蛋白预测。结果显示甜菜PUB基因在甜菜9条染色体上均有定位,并且包含PUB蛋白具有的多个保守结构域,如U-box,Pkinase、Pkinase-Tyr、Usp、Arm以及KAP结构域,以拟南芥U-box家族分类为依据发现甜菜U-box多位于ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ中,甜菜PUB蛋白可作为E3泛素连接酶与多种功能蛋白相互作用,实现泛素化修饰。植物PUB蛋白具有E3泛素连接酶活性,在植物生长发育过程以及抵抗环境压力中起到重要作用。     

拟南芥ft-1突变体对非生物胁迫的响应

对植物生存与生长不利的不良环境称逆境。在逆境条件下,植物往往提早开花,快速完成生活史来适应逆境。因此,开花基因与逆境有着密切的关系。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花基因FLOWERING LOCUST(FT)突变体ft-1和野生型Col-0为材料,对在胁迫下生长的幼苗主根长进行了表型分析。结果显示,在正常条件下生长的ft-1突变体与Col-0根长相似。突变体ft-1和野生型Col-0对NaCl处理显示出极显著差异,且只在高浓度渗透胁迫下表现出显著差异。表明ft-1可能参与植株抗盐过程,与渗透胁迫关系不大。磷盐与钾盐处理与渗透处理结果类似。铵盐下生长的突变体ft-1和野生型Col-0的根长无显著差异,表明ft-1可能不参与铵盐胁迫。硝盐和混合氮盐处理下,两者均产生了极显著或显著差异,表明ft-1可能参与硝盐胁迫过程。     

小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

防御信号途径在B型烟粉虱取食烟草诱导抗蚜防御中的作用

B型烟粉虱取食能够诱导烟草产生对烟蚜的抗性反应,为了明确水杨酸和茉莉酸防御信号途径与烟粉虱诱导抗蚜防御之间的关系,采用生化分析、实时定量PCR、蚜虫生物活性测定等方法比较了烟粉虱若虫取食对烟草水杨酸、茉莉酸含量、通路下游防御基因表达水平的影响及外源水杨酸、茉莉酸对烟蚜生长发育的影响。结果显示：烟粉虱侵染能够显著激活水杨酸防御途径,在取食15天后,水杨酸水平较对照升高1.40倍,水杨酸下游防御基因PR-1a及PR-2a分别较对照升高3.22和0.74倍;然而烟粉虱侵染后烟草叶片茉莉酸含量与对照相比无显著变化,JA下游防御基因PI-II和TPI的转录水平分别较对照降低73.91%和56.73%。生测结果显示,外源施用水杨酸对烟蚜的存活率和相对平均生长率具有显著不利影响。烟草叶片施用1 mmol/L水杨酸后,蚜虫的存活率及相对生长率分别较对照降低43.2%和11.54%;然而喷施茉莉酸甲酯对蚜虫的生长发育无不利影响。上述结果表明,水杨酸介导的防御应答在B型烟粉虱取食诱导烟草的抗蚜防御中起重要作用。     

大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析

WRKY转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程,AtWRKY28是拟南芥中与抗病和耐逆相关的重要转录因子。为探讨大豆中一个AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like(Glyma.14G028900)的生物学功能,本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验,并对其在ABA、PEG、NaCl胁迫下的表达水平进行了分析。结果显示,GmWRKY28-like基因的编码区(CDS)为1008bp,编码335个氨基酸。GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY结构域,含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸(Tyrosine),不含跨膜结构与信号肽;进化树分析表明大豆GmWRKY28-like与菜豆(Phaseolus vulgaris)WRKY28的相似性最高;亚细胞定位显示GmWRKY28-like定位在细胞核中。该基因在根、种子中表达量很低,在真叶、花、及茎尖分生组织表达量较高。GmWRKY28-like启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫应答相关的元件,如MBS、W-box、ABRE、Box-W1等,且表达受到ABA、PEG、NaCl的诱导。此外,过表达GmWRKY28-like显著增强了拟南芥的耐盐性。