棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

小麦NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

AtNPR1是拟南芥系统获得性抗病反应中的关键基因,对拟南芥的广谱抗性起重要调控作用。从赤霉菌诱导的小麦抗、感赤霉病近等基因系RNA差异表达谱中获得3个与AtNPR1类似的EST片段,据此检索相应序列信息并设计引物,采用RT-PCR方法从小麦中克隆得到3个cDNA全长序列,分别命名为TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3,其开放阅读框分别编码580、607和601个氨基酸残基。序列分析表明,这3个小麦NPR1-like蛋白都含有保守的BTB/POZ、ANK和NPR1_like_C结构域及功能氨基酸,但仅TaNPR1具有2个对NPR1寡聚体形成十分必要的保守半胱氨酸残基。蛋白质聚类分析表明,TaNPR1与TaNPR2和TaNPR3的同源性均较低,其中TaNPR1与NPR1蛋白聚为一类,而TaNPR2和TaNPR3均与NPR1同源蛋白聚为一类。荧光定量PCR分析结果显示,TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3基因都可被植物抗病相关信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。与感病材料Apogee相比,抗病近等基因系Apogee73S2中TaNPR1和TaNPR3能够更早地响应赤霉菌的诱导并显著上调表达;而TaNPR2在感、抗材料中对赤霉菌侵染的响应都较为缓慢且变化不明显。这些结果表明,TaNPR1和TaNPR3可能在小麦对赤霉菌的防御反应中起重要作用。     

烟草NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

通过同源克隆法获得烟草抗病基因同源序列(RGAs),为烟草抗病基因的筛选和相关研究提供帮助。基于抗病基因的NBS-LRR保守结构域,筛选并合成了3对简并引物,扩增烟草中的NBS-LRR类抗病基因。获得了4条与抗病基因具有高度同源性的NBS-LRR类烟草抗病基因同源序列(TRGA,登录号:MK634316,MK634317, MK634318, MK634319),目的片段大小均在500 bp左右;BLAST X分析表明,获得的4个烟草RGAs与已知RGAs具有高度相似性,氨基酸相似性为97%～100%;聚类分析将其分成2大类,包括TIRNBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两类抗病基因,其编码氨基酸序列含有NBS保守区的典型特征基序。通过简并引物进行同源扩增是分离烟草RGAs的有效方法,可为进一步抗病基因筛选及抗病分子育种奠定基础。     

梅花PmSOC1-like基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3(Suppressor of overexpression of constans 1/Tomato MADS-box gene 3)是MADS-box家族一员,它能够整合多条开花途径的开花信号,调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花成花转变过程的分子机理,采用RT-PCR的方法从梅花长蕊绿萼中克隆到3个SOC1的同源基因,分别命名为Pm SOC1-1、Pm SOC1-2和PmSOC1-3,并采用荧光定量PCR对3个基因的表达模式进行了分析。序列分析表明,3个基因的编码区长度分别为645 bp(Pm SOC1-1)、654 bp(Pm SOC1-2)和660 bp(Pm SOC1-3);编码的氨基酸长度分别为214,217,219 aa。系统进化结果显示,Pm SOC1-1、Pm SOC1-2和Pm SOC1-3分别与拟南芥SOC1/TM3亚家族中的SOC1、AGL42/71/72和AGL14/19聚为一组。实时荧光定量分析结果表明,3个Pm SOC1-like基因均在茎、叶等营养器官中表达量较高,在花、果实和种子等生殖器官中表达量较低;在梅花花芽分化过程中,3个Pm SOC1-like基因的表达量整体呈下降趋势,推测PmSOC1-like基因可能在诱导梅花由营养生长向生殖生长转变过程中起重要作用。     

玉米BEL1-like基因家族的鉴定、表达和调控分析

BEL1-like(BELL)家族蛋白是植物中普遍存在的一类具有同源异型结构域的转录因子。拟南芥中BELL家族蛋白能与KNOTTED1-like蛋白互作形成异源二聚体,并结合到特异顺式作用元件来调控基因的表达,从而影响植物生长发育进程。本文采用隐马可夫(HMM)模型,在玉米基因组中鉴定到15个BELL家族基因(Zm BELL),分布于7条玉米染色体。通过与拟南芥BELL基因的序列比较将这些基因分为两大类。在玉米8种组织中Zm BELL有不同的表达模式,具有明显的组织表达特异性。基于基因共表达分析及BELL-like蛋白特异结合的顺式元件分析,预测到86个可能受Zm BELL调控的下游靶标基因。这86个基因和12个Zm BELL表达模式相同,并且在基因启动子区存在与BEL1-like蛋白结合的顺式元件。这些结果为进一步解析玉米BELL家族基因的功能和作用机制积累了有价值的资料。     

香蕉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从香蕉基因组DNA扩增出一条与植物抗病基因同源的序列,命名为BRGA1,该同源片段含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守性结构p-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域HD,它与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为23.8%-42.7%。Northern杂交表明BRGA1在香蕉中受水杨酸调控,属诱导型表达。     

大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析

WRKY转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程,AtWRKY28是拟南芥中与抗病和耐逆相关的重要转录因子。为探讨大豆中一个AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like(Glyma.14G028900)的生物学功能,本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验,并对其在ABA、PEG、NaCl胁迫下的表达水平进行了分析。结果显示,GmWRKY28-like基因的编码区(CDS)为1008bp,编码335个氨基酸。GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY结构域,含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸(Tyrosine),不含跨膜结构与信号肽;进化树分析表明大豆GmWRKY28-like与菜豆(Phaseolus vulgaris)WRKY28的相似性最高;亚细胞定位显示GmWRKY28-like定位在细胞核中。该基因在根、种子中表达量很低,在真叶、花、及茎尖分生组织表达量较高。GmWRKY28-like启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫应答相关的元件,如MBS、W-box、ABRE、Box-W1等,且表达受到ABA、PEG、NaCl的诱导。此外,过表达GmWRKY28-like显著增强了拟南芥的耐盐性。     

植物Alfin1-like蛋白家族的研究进展

PHD-finger (Plant homeodomain-finger)蛋白家族作为一个超家族,在调控细胞周期、生长发育和环境适应等方面发挥着重要的作用。Alfin1-like蛋白家族是PHD-finger蛋白的一个亚家族,仅存在于植物类群中。拟南芥基因组中主要包含7个Alfin1-like蛋白：AL1～AL7,它们的基因结构和蛋白结构具有高度的保守性。Alfin1-like家族蛋白在调控染色质状态以及基因转录方面发挥着重要作用,它们可以结合不同甲基化状态的组蛋白,进而参与到植物生长发育等生命活动。同时Alfin1-like家族蛋白在植物响应干旱、低温、盐、ABA以及病原菌等生物和非生物胁迫方面也发挥了重要作用。本研究系统地阐明了Alfin1-like蛋白家族参与的信号转导途径,为今后植物领域的相关研究提供参考。     

东乡野生稻NBS类抗病基因同源片段的克隆及序列分析

根据已知的NBS-LRR 类抗病基因结构中氨基酸的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR扩增及克隆,从东乡野生稻(Dongxiang Oryza rufipogon Griff.)中共获得7个新的NBS-LRR 类抗病基因同源片段.所有7 个抗病基因同源序列均含有NBS-LRR 类抗病基因的保守序列,如P-loop、...     

小麦G2-like转录因子家族基因鉴定与表达模式分析

Golden2-Like (G2-like)转录因子,是属于MYB类转录因子中GARP超家族的成员,在调节叶绿体发育中起重要作用。本研究利用生物信息学方法对小麦G2-like基因进行了全基因组鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位、启动子顺式作用元件及对非生物胁迫和激素的响应模式进行了分析。从小麦中共鉴定出87个G2-like基因,不均匀的分布在小麦21条染色体上,系统发育分析将这些基因分为14个亚族。蛋白质二级结构预测表明,小麦G2-like基因的氨基酸序列均以α螺旋和随机卷曲为主要结构。启动子顺式作用元件分析表明其上游2 kb区域含有7种(P-box、SpI、LTR、ABRE、MBS、TGA-element和AE-box)与逆境胁迫诱导相关顺式作用元件。其中Ta3AG2-like19含有顺式调控元件结合位点最多,一共有18个结合位点。qRT-PCR验证发现,Ta3AG2-like19、Ta3AG2-like20、Ta4AG2-like29和Ta6AG2-like52在PEG和盐胁迫下以及GA、IAA和ABA激素诱导下表达量显著上调,这些基因可能介导了小麦对多种非生物逆境的响应。     

甘蓝型油菜抗菌核病研究进展

油菜是主要油料作物之一,由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)引起的菌核病(sclerotiniastemrot)是油菜的主要病害。针对当前与菌核病相关研究的新进展,本研究从4个方面对其进行了概括：（1）核盘菌的侵染方式以及在侵染过程中核盘菌分泌的草酸与寄主中钙离子的动态关系;（2）油菜通过合成植保素、酚类化合物、木质素、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等来抵抗核盘菌入侵的抗病机理;（3）现有综合防治技术中抗性种质筛选、无花瓣育种和生物防治;（4）利用与草酸代谢相关基因、抗病相关基因、防御相关转录因子基因和抗菌肽基因开展的油菜基因工程研究成果。并且进一步提出了未来油菜抗菌核病研究的可能方向,这些总结与建议为今后油菜抗菌核病研究提供了有益参考。     

SSR结合SRAP标记分析油菜菌核病抗性资源遗传多样性

为了更准确、有效地揭示油菜资源遗传多样性,探索SSR和SRAP 2种分子标记在油菜菌核病抗性资源遗传多样性分析中的应用,采用40对SSR核心引物及陕西理工学院生物学院分子与遗传实验室筛选出的40对多态性高、条带清晰的SRAP引物,对陕西省汉中市农科所经过连续3年牙签茎秆接种试验结合多年的田间抗性表现筛选出的43份菌核病抗性较好的油菜材料进行遗传多样性分析,并对2种分子标记揭示的多态性条带数、多态性信息含量(PIC)进行比较。结果表明:2种标记共检测出634个条带,SRAP标记检测的多态性条带数(335)较SSR(287)高,而SSR引物的平均多态性信息含量(PIC)值较SRAP引物高,分别是0.76和0.69。在遗传相似系数0.67处,43份油菜材料被分为Ⅲ类,白菜型油菜(丰油10号白菜型选系)可较好地与甘蓝型油菜区分。主成分分析(Principal component analysis,PCA)、群体结构分析与聚类分析结果相似,说明SSR与SRAP标记结合能准确有效的反映油菜材料的亲缘关系。供试43份油菜材料遗传相似系数分布在0.65~0.81,表明遗传相似性较高,亲缘关系较近。因此,应进一步加强抗源筛选及引进,对现有材料进行遗传改良,拓宽其遗传背景,从而为抗菌核病油菜品种选育奠定基础。     

转双价广谱抗病基因创造甘蓝型油菜抗菌核病新品种的研究

菌核病严重威胁着我国长江中下游地区甘蓝型油菜的生产，几乎每年都会导致甘蓝型油菜的大面积减产。来自于烟草的葡聚糖酶(Glucanase)基因，其编码产物能降解真菌的细胞壁结构成分一葡聚糖。来自于烟草的植物蛋白AP24则属于细胞程序性死亡(PCD)的诱导蛋白，对多种真菌具明显抑制作用。前期已成功地将这两个广谱抗病基因导入甘蓝型油菜，并且通过表型鉴定，在T0和T1代检测到了核盘菌抗性。本实验对转基因T2代和T3代甘蓝型油菜进行分子鉴定和田间抗病性鉴定。经过PCR分子鉴定，从14个转基因T3代甘蓝型油菜株系中筛选到4个外源基因已经纯合的株系。对株系GA02—2的RT—PCR鉴定则进一步证明外源广谱抗病基因在RNA水平上的大量表达。田间抗性鉴定主要利用苗期离体叶接种和成株期茎杆插签接种这两种方法。结果表明，T2代转基因株系中有5个株系表现为抗病基因初步纯合，5个株系表现为隐性纯合，12个株系处于分离当中，其中株系GA02—2的抗病性鉴定结果与RT—PCR鉴定的结果吻合。18个T3代转基因甘蓝型油菜株系中有7个株系表现为抗性纯合，3个株系剖现为隐性纯合，其余8个株系基本上仍在分离中，其中株系GA02—2—1的抗病性鉴定结果与前面的分子鉴定以及上代的抗病性鉴定完全吻合。综合分子鉴定和抗病性鉴定结果，筛选出抗病效果良好的转基因纯合株系应用于抗病育种。     

甘蓝型油菜BnCOP9基因的克隆及其环境信号响应分析

植物COP9(Constitutively photomorphogenic 9)信号体(CSN)是一个多亚基复合体,而CSN8是这个复合体必不可少的亚基。为了克隆油菜CSN8基因并分析其在各种环境信号下的表达变化,以甘蓝型油菜中双9号为材料,采用同源克隆法克隆油菜CSN8(BnCOP9)cDNA。序列分析表明,BnCOP9编码的蛋白含有197个氨基酸残基,在其蛋白质中部含有1个PCI结构域,与Arabidopsis thaliana CSN8(AtCOP9)有92%的相似性。定量RT-PCR分析显示,Scle-rotinia sclerotiorum、伤处理以及甲基茉莉酸快速激活BnCOP9的表达,苯丙噻重氮抑制其表达,表明BnCOP9作为各种环境信号的响应基因在水杨酸和茉莉酸信号的交叉谈话中及油菜对S.sclerotiorum和机械伤害反应的网络中起作用,这些结果为研究BnCOP9在油菜抗逆中的作用提供线索。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析

菌核病是油菜主要病害, 至今尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。本研究利用qRT-PCR法比较了抗病品种宁RS-1和感病品种APL01在接种核盘菌后0~48 h内11个防御相关基因的表达差异, 以揭示抗病品种宁RS-1的抗病机制。结果表明, 4个基因(PGIP、Cu/ZnSOD、OXO和GLP)在核盘菌诱导前后抗、感品种内表达量均较高, 且抗病品种的表达量显著高于感病品种, 尤其是PGIP基因, 抗病品种宁RS-1在24 h的表达量为诱导前的170.4倍, 而感病品种仅为诱导前的3.5倍, 该时期抗病品种PGIP的表达量为感病品种的1299.4倍;2个基因(LOX2和PDF1.2)在诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 但抗、感品种间表达量差异显著;5个基因(FeSOD、PAL、EDS1、PR1和EIN3)诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 且抗、感品种间的表达量差异不显著。推测抗病品种宁RS-1对菌核病的抗性可能是由于PGIP的上调表达, 抑制了核盘菌PG蛋白对侵染部位油菜组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜菌核病的发生与蔓延。     

以器官和发育特异性抗病双基因转化油菜

菌核病是我国油菜主产区的主要病害，系由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的子囊孢子在晚春直接侵染开花植株衰老的叶片，或先侵染飘落在衰老叶片上的花瓣后再产生菌丝侵入叶片和植株本体。几丁质是核盘菌菌丝体细胞壁的主要组成成分，几丁质酶破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病菌的生长。草酸是核盘菌侵染寄主植物后分泌的毒素，草酸氧化酶能够分解草酸，缓解核盘菌在油菜体内的毒性。我们将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因与拟南芥衰老叶片启动子PSAG12嵌合在一起构建成表达载体，使两外源抗病基因仅在转基因油菜的衰老叶片中表达，在发挥抗病作用的同时最大限度地节约了植物的能量消耗。本实验采用in planta的转化方法，转化效率在0．1％左右，每个转基因植株的插入位点为1——3个拷贝。对T1代转基因植株的RT-PCR分析表明，两个外源抗病基因在衰老叶片中的表达强于幼嫩叶片。转基因植株叶片尤其是衰老叶片对核盘菌的抗性及对草酸毒素的耐性均得到了增强。从转基因植株上飘落的花瓣也表现出对核盘菌抗性的提高。抗病双基因在叶片和花瓣发育的特定时期表达不仅提高了油菜对核盘菌侵染的针对性，还可能减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱。对转基因植株后代的农艺学和生理学研究正在进行之中。     

甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶I基因的克隆及表达模式

DNA甲基化作为一种表观遗传调控方式,在植物体生长发育中起重要作用,而甲基转移酶I(DNA methylase I,MET1)在甲基化过程中起主要作用。本研究克隆到5个油菜Bn MET1同源基因,并比较了白菜Br MET1、甘蓝Bo MET1和油菜Bn MET1同源基因的进化及其表达模式。结果显示,白菜和甘蓝MET1同源基因在进化中较为保守,而油菜Bn MET1基因结构发生较大改变;部分油菜Bn MET1同源基因表达发生沉默,而激活表达的Bn MET1表达模式较其亲本白菜和甘蓝直系MET1同源基因发生明显的改变。上述结果表明,Bn MET1同源基因通过改变基因结构以及表达模式影响油菜组织中Bn MET1基因剂量,从而调节油菜的生长发育。     

BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性

植物MAPKs (mitogen-activated protein kinases)在多种生物和非生物胁迫中起重要作用。课题组前期克隆了甘蓝型油菜BnMAPK1基因,并获得BnMAPK1超量表达植株。本文以甘蓝型油菜中油821DH系为对照,以超量表达BnMAPK1的转基因油菜为试材,采用离体叶片接种的方法,测定染病叶片病斑的大小及病斑周围叶片的草酸含量,并用qRT-PCR检测转基因植株4个病程相关蛋白(OXO、Cu/ZnSOD、PR2、PR3)编码基因在核盘菌胁迫下的相对表达动态变化。结果表明,甘蓝型油菜BnMAPK1超量表达可显著抑制核盘菌对离体叶片的侵染,控制染病叶片内草酸毒素的积累,可能可以解除核盘菌对OXO表达的负调控,使另外3个病程相关蛋白基因(Cu/ZnSOD、PR2、PR3)表达上调。表明BnMAPK1超量表达可有效提高油菜菌核病抗性。