分泌AFP的人肝癌细胞株中阳离子脂质体介导肝癌组织特异性载体的表达

目的 :研究阳离子脂质体 (cationicliposome)介导甲胎蛋白 (α fetoprotein ,AFP)启动子 /增强子载体在分泌AFP的人肝癌细胞株中的靶向表达。方法 :测定比较阳离子脂质体Lipofectin介导质粒pDR2 luc、pEBAFluc转染分泌AFP的人肝癌细胞株 (HepG2 )、不分泌AFP的人肝癌细胞株 (SMMC772 1 )、人肾癌细胞株 (GRC)及非洲绿猴肾细胞(COS7)的转染效率 ,通过液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性 ,估计转染效率。结果 :①以Lipofectin介导pDR2 luc转染 4株细胞 ,荧光素酶活性在 4株细胞中均能表达 ,且表达活性差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;②以Lipofectin介导pEBAFluc转染 4株细胞 ,荧光素酶活性仅在能分泌AFP的HepG2 中表达。结论 :含人AFP启动子 /增强子的载体pEBAFluc在分泌AFP的人肝癌细胞株中可靶向表达     

pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体的构建及在PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体介导下转染肝癌细胞

目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组真核表达载体,并检测其在AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达.方法:PCR 扩增AFP 基因启动子、HSV-TK基因,将上述片段插入EGFP-N1载体的多克隆位点,构建pEGFP-AFP-TK重组表达载体,通过包裹PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体,经其介导,转染AFP 阳性肝癌细胞株HepG2 和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721, 利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法检测目的基因在2种细胞系中的表达.结果与结论:肝癌特异性真核表达载体pEGFP-AFP-TK构建成功.利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法可以检测到嵌合AFP启动子的pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体能够特异性在AFP阳性的肝癌细胞株表达,而在AFP阴性的肝癌细胞株中基本不表达.     

肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究

目的:探索应用肿瘤细胞特异启动子hTERT介导靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA在卵巢肿瘤细胞特异表达并逆转MDR的可行性。方法:应用携带luc报告基因的报告质粒验证了hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中的转录活性,构建由hTERT启动子引导的靶向mdr1基因的siRNA表达载体phTERTsiMDR1B,并与携带mdr1基因靶序列的报告质粒进行共转染抑制实验,进一步将phTERT-siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染A2780细胞,检测细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平。以具有耐紫杉醇表型的A2780细胞作为靶细胞进行耐药评价实验。结果:hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中具有良好的转录活性,而在正常人二倍体细胞株MRC-5中无转录活性;hTERT启动子介导的siMDR1B具有良好的抑制效果与特异性;hTERT启动子介导的siMDR1B可显著抑制细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平;转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低。结论:hTERT启动子介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR是可行的,本研究结果可为进一步开展卵巢肿瘤MDR逆转研究提供重要基础。     

不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析

目的分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法将AF0．3启动子插入载体pcDNA3．0，构建肝癌细胞特异表达载体pAF0．3；将PNP基因分别插入到pcDNA3．0和pAF0．3中，构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP和pAF0．3／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达，分析二者表达的不同。结果各目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在各株细胞中均实现了表达，而AF0．3启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达。结论两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体，且pAF0．3／PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达。     

靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.     

重组腺病毒载体携带凋亡素基因对肝癌细胞的作用

目的 探讨带有AFP启动子的重组腺病毒载体介导凋亡素基因对肝癌细胞的作用.方法 测定腺病毒AdAFPvp3滴度,并以MOI=100感染Hepal-6肝癌细胞(AFP ),HEK293细胞(AFP-),Lewis肺癌细胞(AFP-),24 h后Hoechst 33258染色观察凋亡形态学改变,RT-PCR检测vp3基因的表达.腺病毒AdAFPvp3以MOI=100感染hepal-6肝癌细胞,FCM检测肝癌细胞不同时段凋亡率.结果 腺病毒AdAFPvp3滴度为5×10(9)PFU/ml.Hoechst 33528染色显示甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞出现凋亡形态学改变,RT-PCR检测只有甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞表达vp3mRNA.FCM表明凋亡素基因能有效诱导肝癌细胞凋亡.结论 带有特异性甲胎蛋白启动子的重组腺病毒载体.介导凋亡素基因导入肝癌细胞后,对于能合成甲胎蛋白的肝癌细胞,具有特异性靶向性致凋亡作用.     

PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达93.99%. HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P＜0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为66.91%. 结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.     

AFP启动子调控增强型绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的研究

目的研究人0.3 kb的AFP启动子序列对EGFP在人肝癌细胞中表达的影响.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子(AFP promoter)序列,分别构建含有AFP启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及AFP启动子序列和DTA基因的真核表达载体pAF-EGFP、pAF- DTA;将pAF- EGFP转染HepG2、SMMC-7721及NIH3T3后进行荧光强度检测.结果转染pAF-EGFP质粒细胞的EGFP表达量在HepG2细胞中明显高于SMMC-7721、NIH3T3细胞,组间差异显著(P<0.01).结论 AFP启动子可以特异性地启动它后面的目的基因在AFP阳性的细胞中高效表达.     

人源肝癌细胞系中甲胎蛋白基因表达及甲基化的研究

目的:了解不同人源肝癌细胞系甲胎蛋白(AFP)基因表达及不同区域甲基化状态,探讨肝癌发生的表达遗传学调控机制。方法:采用亚硫酸氢盐-基因组测序(bisulfite-assisted genomic sequencing,BAGS)技术,检测人源HepG2、SMMC-7721肝癌细胞系和人成纤维细胞中AFP基因启动子区及CpG岛区的甲基化水平,RT-PCR检测基因的表达,并分析相关性。结果:HepG2细胞高表达AFP,SMMC-7721细胞低表达AFP,成纤维细胞不表达AFP;在启动子区,HepG2细胞的非甲基化修饰位点发生率较高,尤其是第一个和第二个CG位点,SMMC-7721细胞的甲基化程度较之高,而成纤维细胞甲基化程度整体很高;在CpG岛区,成纤维细胞的非甲基化修饰位点发生率较高,主要是第6个和第7个CG位点,SMMC-7721、HepG2细胞的甲基化程度较之高。结论:AFP基因启动子甲基化程度与基因表达水平存在负相关,AFP基因CpG岛甲基化程度与基因是否表达有关,AFP基因启动子低甲基化可能是AFP高表达的分子机制。     

载体介导的RNA干扰技术对甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。     

共济失调-毛细血管扩张症致病基因RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的:观察共济失调-毛细血管扩张症致病基因(ATM基因)的RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响.方法:选择ATM基因不同区域的DNA序列合成并纯化寡核苷酸后转染人胚胎肾脏细胞HEK293,根据对ATM蛋白不同的阻断效应,筛选用于制备ATM发夹结构short hairpin structure(shRNA)基因的最佳序列.将有效序列克隆入pSilencer 1.0-U6载体中,构建出shRNA的表达质粒并转染恶性胶质瘤细胞系U87细胞.以U87细胞为对照,应用Western blot检测细胞中ATM基因的表达;以细胞存活分数(SF)来评估放射敏感性.结果:Western blot显示shRNA介导的ATM基因沉默能明显阻断U87细胞中的ATM蛋白;与U87细胞相比,U87 shRNA细胞SF明显降低,P＜0.05.结论:由ATM shRNA构建的表达质粒能明显抑制ATM表达,增加胶质瘤细胞的放射敏感性.     

以HBV e基因为靶点的RNA干扰研究

目的：针对HBV前C／C基因的siRNA表达载体pSiHBV／C，和含HBV前C／C基因（e抗原基因）及绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP—HBVC（1或4），共转染真核细胞，观察RNA干扰对HBVe抗原基因表达的抑制作用。方法：脂质体共传染pSiHBV／C和pEGFP—HBVC真核细胞，通过观察荧光强度及利用蛋白免疫印迹进行半定量分析来检测RNA干扰作用对HBV e抗原基因表达的抑制效果。结果：针对HBV前C／C基因的siRNA表达载体pSiHBV／C与pEGFP—HBVC共转染真核细胞后，可明显抑制融合蛋白的表达。结论：在细胞水平上，针对HBV前C／C基因的siRNA表达载体pSiHBV／C产生的siRNA可特异的抑制HBV e抗原基因的表达。     

siRNA介导表皮生长因子受体基因沉默导致HepG2凋亡

目的：研究含有与EGFR基因序列相同的19nt序列RNAi质粒针对HepG2细胞表皮生长因子受体的RNA干扰效果。方法：用pSIREN-hE转染细胞，其质粒骨架为RNAi-Ready pSIREN-Shuttle Vector，含有可以被U6启动子转录成shRNA的寡核苷酸链，大小为69nt，含有2段19nt的寡核苷酸，用于编码EGFR基因的RNA干扰的siRNA的正义链及反义链，评价该RNAi质粒对人肝细胞癌细胞株（HepG2）EGFR基因的mRNA表达抑制效果及对细胞凋亡的作用。结果：HepG2细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制并伴有凋亡增加。结论：含有与EGFR基因序列相同序列RNA质粒对EGFR基因的RNA干扰可能是治疗肝细胞癌的一种有效手段。     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞(hDCs)信号传导通路抑制因子1(SOCS1)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因(NM-0037),筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(含U6启动子和EGFP)连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

小干扰RNA对类风湿关节炎相关的人白细胞抗原-DRB1*0405蛋白表达的抑制作用

目的探讨人类白细胞抗原（HLA）DRB1＊0405小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对类风湿关节炎（RA）相关的HLA-DRB1＊0405蛋白表达的影响。方法构建HLA-DRB1＊0405蛋白表达质粒siCHECK^TM-2／HLA-DRB1＊0405,同时针对HLA-DRB1＊0405基因序列设计并构建6个小发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达质粒和1个针对无关序列的shRNA表达质粒。脂质体瞬时共转染两种质粒至人胚胎肾细胞293,以仅转染HLA-DRB1＊0405蛋白表达质粒作为阴性对照,采用实时荧光定量PCR检测293细胞中HLA-DRB1＊0405 mRNA的表达,通过测定荧光素酶强度分析293细胞中HLA-DRB1＊0405蛋白水平。结果所设计的6个HLA-DRB1＊0405 siRNA可不同程度的抑制HLA-DRB1＊0405在293细胞中的表达,对mRNA水平,其抑制率最高可达89．25％,而在蛋白水平,其抑制率达46．70％。结论质粒介导的HLA-DRB1＊0405 siRNA可明显抑制HLA-DRB1＊0405在人胚胎肾细胞株293中的表达,为利用RNA干扰（RNA interference,RNAi抑制RA中HLA-DRB1介导的异常免疫反应提供了试验依据。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

应用载体介导的RNAi技术抑制Bcl-2的表达

目的　应用载体介导的RNAi技术特异地干扰抗凋亡基因bcl 2在HeLa细胞中的表达。方法　构建利用H1启动子转录功能性siRNA的载体 ;在H1启动子下游分别插入含不同bcl 2基因特异性序列的 64nt寡核苷酸片段 ;将构建的质粒转染HeLa细胞 ,以间接免疫荧光和免疫印迹检测转染后细胞中Bcl 2的表达水平。结果　 3种含不同bcl 2特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在细胞中的表达 ,但干扰的效果存在差异 ,从 45 %～ 83 5 %。结论　本研究建立的载体介导的RNAi技术可成功地用于干扰Bcl 2在HeLa细胞中的表达     

RNA干扰沉默IGF-I R表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的:评价RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体(IGF-I R)表达的阻断效应,和IGF-I R基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变.方珐:应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF-I R特异性小干扰RNA(siRNA),经RT-PCR和Western blot检测IGF-I R表达的改变;联合应用化疗药物顺铂(DDP),通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量(IC50)的变化.结果:IGF-I R表达水平明显下降(抑制率高达89.8%),肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24 h、48 h、72 h的IC50均明显减少,IGF-I R siRNAl组DDP作用72h的IC50为0.92 mg/L,明显低于control-siRNA组的3.77 mg/L,0.5 mg/L DDP联合IGF-I R siRNAl作用48 h后,A549细胞的生长抑制率达32.1%,明显高于control-siRNA组的18.9%,细胞凋亡率从27.8%上升至44.2%.结论:运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-I R的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加.