核因子-κB/p65 siRNA介导的舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡及相关分子机制

目的：研究下调核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）/p65基因的表达对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的影响,并探讨Tca8113细胞凋亡可能的分子机制。方法：利用脂质体2000将终浓度为100nmol/L的p65 siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,通过RT-PCR检测0、24、48和72hp65 mRNA的表达,并通过流式细胞术检测转染前后细胞凋亡变化,通过Caspase-Glo○R-3/7,-8和-9检测试剂盒分析caspase-3/9活性,用Western blotting技术检测p65、bcl-2和bax蛋白表达。结果：Tca8113细胞转染p65siRNA后,在48hp65 mRNA的相对表达量为0.181±0.028,显著低于未处理组0.595±0.038和对照siRNA组0.613±0.067（P〈0.05）。流式细胞术结果显示,p65 siRNA能促使Tca8113细胞凋亡,其早期凋亡比率为（23.16±1.72）%,显著高于未处理组和对照siRNA组（P〈0.01）。转染48h后,p65和bcl-2蛋白的相对表达水平明显下调,而促凋亡蛋白bax的表达显著上升,并伴随着caspase-3/9活性的显著上升。结论：NF-κB信号途径中的p65亚基可能在舌鳞状细胞癌凋亡中发挥重要作用,该研究有望为舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据。     

Naa10p 表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素敏感性的影响

目的：观察 N-α乙酰基转移酶（Naa10p）表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素（PYM）敏感性的影响。方法：采用慢病毒体系分别构建干扰及过表达 Naa10p 的 Tca8113细胞株,并设立相应的对照细胞 Tca8113-LV-NC,鉴定干扰和过表达效率,MTS 法检测药物处理后各处理组细胞对 PYM的敏感性。结果：干扰 Naa10p 的 Tca8113-LV-shNaa10p 细胞、过表达Naa10p 的 Tca8113-LV-Naa10p 细胞与对照细胞 Tca8113-LV-NC 对平阳霉素的半数抑制浓度（IC50）分别为（20．772±0．106）μg／ml、（2．157±0．123）μg／ml、（6．301±0．069）μg／ml（组间比较,P ＜0．05）。结论：下调 Naa10p 表达可降低口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性,上调 Naa10p 表达可增强口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性。     

Bcl-xL反义寡核苷酸与博莱霉素协同抑制鳞状细胞癌细胞增殖的研究

目的：研究bcl-xl反义寡核苷酸（ASODN）与博莱霉素（BLM）联用对口腔鳞状细胞癌细胞（Tca8113）增殖的影响及其作用机理。方法：设计合成bcl—xl的ASODN在脂质体的介导下转染Tca8113细胞,设无义寡核苷酸组（NSODN）和空白对照组进行比较。48h后博莱霉素作用于转染后的细胞。以荧光原位末端缺口标记法检测bcl-x1反义寡核苷酸与博莱霉素诱导癌细胞凋亡的作用机理,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：bcl-xl反义寡核苷酸与博莱霉素的作用机理为激活细胞的内源性核酸内切酶,使核小体内DNA断裂出现缺口,产生凋亡。ASODN组、BLM组和ASODN＋BLM组的凋亡率明显高于NSODN组和空白对照组（P〈0．05）。ASODN＋BLM组的凋亡率明显高于ASODN组和BLM组（P〈0．05）。结论：Bcl-xL反义寡核苷酸与博莱霉素能协同抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。     

粘着斑激酶对Tca8113舌鳞癌细胞生物学特性的影响

目的研究粘着斑激酶（FAK）在Tca8113舌鳞癌细胞中的表达及对其生长、粘附、侵袭转移能力的影响。方法采用FAK寡核苷酸转染的方法处理Tca8113舌鳞癌细胞,采用逆转录- 聚合酶链反应（RT- PCR）测定FAKmRNA水平的变化,间接免疫荧光方法检测胞浆FAK蛋白的表达,以Transwell小室和冲刷实验的方法计数细胞,测定细胞的粘附和侵袭能力的变化,MTT法检测细胞的生长抑制情况。结果反义FAK寡核苷酸转染后,Tca8113细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低。转染48 h后,FAKmRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。结论FAK对Tca8113细胞的增殖、存活、粘附及侵袭具有重要作用。     

细胞周期蛋白D1反义寡核苷酸调控联合顺铂抑制口腔鳞癌耐药细胞的研究

目的通过体内外实验探讨细胞周期蛋白（cyclin D1）与舌鳞状细胞癌对顺铂（CDDP）耐药细胞系（Tca8113/CDDP）耐药的相关性.方法通过脂质体将cyclin D1正义、反义寡核苷酸序列分别导入Tca8113/CDDP细胞内.用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测转染细胞系和耐药细胞系体外生长增殖情况及对顺铂的敏感性.将被转染的细胞及Tca8113/CDDP细胞接种于裸鼠皮下,建立移植瘤模型,共18只,每组6只.给予顺铂腹腔注射治疗,观察移植瘤体积变化,绘制生长曲线;称取瘤重,计算抑瘤率;光镜下观察移植瘤组织病理学变化.结果转导mRNA 3＇cyclin D1反义寡核苷酸的Tca8113/CDDP细胞在动物体内外生长明显受到顺铂的抑制;裸鼠皮下移植瘤抑瘤率达74%（P＜0.05）,移植瘤重量较对照组和转导正义寡核苷酸序列组差异均有统计学意义（P＜0.05）;光镜下可见反义寡核苷酸组移植瘤坏死明显.结论cyclin D1基因的反义调控联合顺铂能抑制Tca8113/CDDP细胞的生长能力及体内移植瘤的生长.研究结果提示：抑制cyclin D1可能增加口腔鳞状细胞癌对顺铂的敏感度.     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通路介导的p53基因抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的实验研究

目的 探讨人重组p53腺病毒（rAd-p53）注射液抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的分子机制。方法 采用 rAd-p53注射液转染人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113,观察p53基因过表达对该细胞系增殖及侵袭能力的影响,并用蛋白免疫印迹的方法检测Ad-p53转染前后Tca8113细胞系内丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路相关蛋白,细胞周期及凋亡调控蛋白细胞周期素D1（Cydin D1）、P21、Bcl-2的表达。结果 Ad-p53 转染后显著抑制Tca8113细胞系增殖和侵袭（P<0.01）,并促进细胞凋亡（P<0.001）。蛋白免疫印迹结果显示,rAd-p53 转染后显著提高了Tca8113细胞P53和P21蛋白的表达,同时显著下调了Cydin D1、Bcl-2蛋白的表达及AKT蛋白的磷酸化（P<0.01）。结论 AKT信号通路可能是p53引起的口腔鳞癌细胞增殖和侵袭抑制的关键分子机制,Cyclin D1、P21和Bcl-2蛋白可能是AKT信号通路的下游调控基因,AKT信号通路及下游调控基因有望成为肿瘤基因治疗靶点。     

慢病毒介导COX-2基因沉默对舌鳞癌Tca8113细胞株药物敏感性的影响

目的:研究COX-2基因沉默表达对舌鳞癌Tca8113细胞药物敏感性的影响。方法:运用RNA干扰技术,构建慢病毒介导的针对COX-2基因的干扰载体,以其感染舌鳞癌Tca8113细胞,沉默其COX-2表达;采用Western-blot方法检测正常细胞以及敲除目的基因细胞COX-2蛋白表达水平;运用MTT方法观察Tca8113细胞在COX-2基因沉默后对平阳霉素及顺铂敏感性的变化。结果:western-blot结果显示,感染慢病毒载体后的细胞COX-2蛋白表达显著下降;MTT结果显示,对相同浓度的平阳霉素和顺铂,COX-2基因沉默组细胞生长抑制率较对照组细胞高(P<0.05)。结论:运用慢病毒介导RNA干扰技术,成功建立稳定沉默COX-2的舌鳞癌细胞株,COX-2沉默后增强了Tca8113细胞对平阳霉素及顺铂的药物敏感性。     

反义hTR对舌鳞癌细胞系Tca8113作用的初步探讨

目的：观察反义hTR对人舌鳞癌细胞系Tca8113的影响及其与细胞周期和凋亡的关系。方法：脂质体介导真核表达载体PBBS212－hTR转染Tca8113细胞系，运用流式细胞仪技术观察细胞周期的改变和凋亡，并结合免疫组化和原位杂交技术分析转染前后某些基因表达的变化，结果：转染反义hTR的Tca8113细胞克隆生长减缓，群体倍增时间较未转染和转染空质粒组明显延长，流式细胞仪显示转染细胞PI指数下降，有亚二倍体凋亡峰出现，转染后细胞p21基因表达水平显著增高，裸鼠移植瘤实验显示转染后的Tca8113致瘤性减弱，结论：反义hTR可引起细胞通过细胞周期关卡受阻而显著抑制Tca8113细胞的生长，同时激活了某些凋亡程序而导致细胞凋亡，端粒酶可能是肿瘤基因治疗的理想靶点。     

p27kip1基因转染与化疗药联合应用对舌癌细胞生长的影响

目的探讨人p27^kip1基因转染与化疗药联合应用对舌癌细胞生长的影响。方法从正常组织中克隆人p27^kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上，应用脂质体将重组质粒转染舌癌Tca8113细胞，观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达，以及转染与未转染细胞加用化疗药物后的生长情况。结果成功克隆p27^kip1 cDNA并构建p27^kip1真核表达载体，将其导入Tca8113细胞中，经G418筛选得到稳定表达p27^kip1基因的细胞株，转染p27^kip1基因的细胞显示了对化疗药长春新碱的敏感性增高。结论p27^kip1基因转染提高了化疗药对舌癌Tca8113细胞生长抑制作用。     

Cyclin D1反义寡核苷酸对Tca8113/CDDP细胞基因转录表达的影响

目的：构建细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的反义寡核苷酸真核表达载体,并检测其转染Tca8113／CDDP细胞系后的表达情况。方法：以Tca8113／CDDP细胞总RNA为模板,应用RT-PCR法扩增cyclinD1全长．通过克隆至pUCm-T载体中,测序完全正确;经IPrG诱导,可正确表达蛋白。上下游分别利用HindIII和EcoRI的酶切位点插入真核表达载体pcDNA3．1,测序鉴定;并构建表达cyclin D1反义寡核苷酸的2个重组载体,通过Lipofectamine将其导入Tca8113／CDDP细胞系中,G418筛选获得阳性稳定表达细胞系：通过RT-PCR、免疫组化检测cyclin D1基因转录和蛋白表达。结果：成功构建pcDNA3．1-cyclin D1真核表达载体,分别命名为pcDNA3．1空载体（Co）、cyclin D1 mRNA 5’端为靶区的反义载体(C5’)、cyclin D1 mRNA 3’端为靶区的反义载体(C3’)、cyclinD1正义载体(CDl)。3’端反义寡核苷酸转染细胞后,cyclin D1 mRNA表达水平降低58．8％,mRNA5’端反义寡核苷酸组无明显抑制。免疫组化结果显示,转导正义寡核苷酸组cyclin D1阳性表达为最高,转导mRNA3’端、mRNA5’端反义寡核苷酸组为弱阳性表达。结论：cyclin D1 mRNA3’端反义寡核苷酸能明显抑制cyclin D1在Tca8113／CDDP中的表达,为进一步研究逆转Tca8113／CDDP耐药性提供了实验工具。     

转染BMPⅡ型突变受体前后Tca8113舌癌细胞中p27和p57表达的定量分析

目的：明确转染BMP—Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用，以进一步探讨、认识BMPs对口腔上皮恶变的作用机理。方法：检测转染BMP—Ⅱ型突变受体的Tca8113舌癌细胞(Tca8113ZR细胞)和Tca8113细胞的细胞周期相关因子p27和p57的表达，以明确突变受体对细胞周期及生长的影响。结果：转染了BMPⅡ型突变受体后，肿瘤细胞的增殖能力显著减弱。结论：BMPs信号在口腔舌癌细胞的恶性变化中起着重要的调控作用，BMPs信号的改变可能导致细胞的恶性程度的改变。     

Tca8113舌癌细胞转染骨形成蛋白-Ⅱ型突变受体前后细胞周期相关因子表达的定量分析

目的明确转染骨形成蛋白(BMP)-Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用,以进一步探讨BMPs对口腔上皮恶变的作用机制。方法检测转染BMP-Ⅱ型突变受体的Tca8113舌癌细胞(Tca8113ZR细胞)和Tca8113细胞的细胞周期相关因子Cyclind1、CDK-4、p27和p57的表达。结果转染了BMP-Ⅱ型突变受体后,肿瘤细胞的增殖能力显著减弱。结论BMPs信号在口腔舌癌细胞的恶性变化中起着重要的调控作用,BMPs信号的改变可能导致细胞恶性程度的改变。     

平阳霉素抑制舌鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制

目的:探讨平阳霉素体外抑制口腔鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制。方法:用不同浓度的平阳霉素培养人舌鳞癌细胞系Tca8113不同时间,以MTT法和荧光显微镜观察细胞增殖抑制情况,流式细胞术分析细胞凋亡率。结果:MTT法和荧光观察显示:不同浓度平阳霉素组间细胞生长抑制率有显著差异(P<0.05),浓度越高,抗增殖效应越明显;随药物作用时间延长,肿瘤细胞生长受抑制递增(P<0.05)。流式细胞术显示:凋亡率随药物浓度增加而增加,但与作用时间长短无关。低浓度药物无法诱导细胞凋亡。结论:平阳霉素在体外能明显抑制人舌鳞癌细胞系Tca8113生长,并具有浓度和时间依赖性。其抗癌机制可能包括细胞毒作用和启动程序化死亡信号等。     

X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白与口腔鳞癌细胞Tca8113化疗耐药的关系

目的研究X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达水平,并探讨XIAP表达与Tca8113细胞对化疗药物耐药性之间的关系。方法用平阳霉素（PYM）间歇性加药,逐步递增剂量,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测药物处理前后细胞对PYM的敏感性,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测XIAP在药物处理前后的各Tca8113细胞组中的表达变化,并探讨XIAP与细胞耐药性的关系。结果Tca8113细胞在PYM间断作用下产生耐受,Tca8113-1-10组、Tca8113-10-10组耐药细胞对PYM的半数有效浓度（IC50）分别为（12.758±0.030）、（18.986±0.150）μg·mL-1。Tca8113-1-20、Tca8113-10-20组耐药细胞对PYM的IC50分别为（26.302±0.072）、（35.294±0.115）μg·mL-1。XAIP的表达水平与细胞对PYM的耐药有相关性（P<0.01）。结论XIAP在口腔鳞癌中的表达水平升高,可能与鳞癌的化疗耐药性有关,这可作为口腔鳞癌基因治疗的一个新靶点。     

腺病毒介导HSV-TK/GCV系统治疗舌癌的实验研究

目的　探讨腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (herpessimplexvirusthymidinekinase,HSV TK) /丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)自杀基因系统对舌鳞癌细胞系的治疗作用。方法　RT PCR检测重组腺病毒感染Tca8113舌鳞癌细胞系后TK基因的表达情况 ;MTT法检测HSV TK/GCV系统对舌癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果　AdCMVHSV TK可在舌癌细胞中表达TK基因并具有高转染率 ;HSV TK/GCV系统对舌癌细胞具有杀伤作用 ,杀伤呈时间和剂量依赖性 ;但该系统的旁观者效应差。结论　HSV TK/GCV自杀基因系统对舌鳞癌细胞系具有一定的杀伤作用     

短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

钾离子通道阻滞剂4-AP 对人舌鳞癌 Tca8113细胞增殖的影响

目的：检测4-氨基啶（4-AP）对 Tca8113细胞株增殖的影响。方法：采用 CCK-8法检测不同浓度4-AP 作用于 Tca8113细胞株12、24、48 h 后对细胞的增殖抑制率;流式细胞术（FCM）检测各组细胞周期变化。采用 SPSS19．0软件对数据进行统计学分析。结果：随着4-AP 浓度的增加和干预时间的延长,Tca8113细胞形态发生改变。在浓度5～100 mmol／L 范围内作用于细胞12～48 h,4-AP 浓度和时间依赖性地抑制了 Tca8113细胞的增殖（P ＜0．01）。不同浓度4-AP 作用于 Tca8113细胞株24 h后,G0／G1期的细胞所占的比例显著升高（P ＜0．01）;S 期细胞所占的比例显著降低（P ＜0．01）;4-AP 阻滞 Tca8113细胞株于G0／G1期。结论：4-AP 可能通过调控细胞周期抑制 Tca8113细胞株的增殖对细胞株分布有影响。