Caveolin-1RNA干扰真核表达载体的构建及其对人类胃癌细胞生物学行为的影响

 目的　构建针对Caveolin-1（CAV1）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体psilence 4.1-CMV-neo-CAV1并转染胃癌细胞株SGC7901,探讨siRNA抑制CAV1表达对人类胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响。方法　根据 GeneBank提供的CAV1基因核苷酸序列,设计并化学合成3对双链siRNA,瞬时转染胃癌细胞株SGC7901,通过半定量RT-PCR检测各转染细胞CAV1表达,筛选一个有效的siRNA序列。设计并合成能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,构建CAV1基因的RNA干扰真核表达载体,稳定转染胃癌细胞株SGC7901, RT-PCR法鉴定SGC7901细胞中CAV1基因的表达,通过细胞生长曲线、克隆形成实验及流式细胞术检测抑制CAV1的表达对胃癌细胞生长增殖的影响。结果　成功构建CAV1 RNA干扰真核表达载体psilence4.1-CMV-neo-CAV1,稳定转染靶细胞后显著降低CAV1的表达,与转染空载体组比较,增生指数及集落形成率增高,差异有统计学意义（分别为t＝7.98,P＜0.05;t＝13.19,P＜0.01）,生长速度亦增快。结论　RNA干扰胃癌细胞CAV1的表达促进了胃癌细胞生长增殖能力。     

敲低PRMT5基因表达对胃癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制

目的 观察蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）在胃癌细胞中的表达,探讨敲低PRMT5表达水平后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法 Western blot检测胃癌细胞系MGC803、SGC7901、MKN45和人胃黏膜上皮细胞GES-1中PRMT5蛋白表达水平,转染siRNA1和siRNA2质粒敲低PRMT5的表达水平,细胞增殖和凋亡实验、Transwell实验分别检测细胞增殖能力、凋亡率和细胞的侵袭能力,Western blot检测β-catenin、Cyclin D1和Bax蛋白表达水平。结果 与GES-1细胞比较,MGC803、SGC7901和MKN45细胞中PRMT5蛋白表达水平增加（P<0.001）。敲低PRMT5表达后细胞的增殖和侵袭能力减弱,凋亡率增加（P<0.05）,β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达降低,Bax蛋白的表达增加（P<0.001）。结论 PRMT5在胃癌细胞中表达水平升高,敲低其表达水平后可通过减弱Wnt/β-catenin信号通路转导抑制细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡。     

Midkine shRNA对胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响

目的:研究shRNA 干扰midkine对胃肿瘤细胞SGC7901生物学特性的影响.方法:构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒,采用脂质体2000转染SGC7901细胞,检测细胞的增殖和克隆形成能力以及细胞凋亡情况.结果:与对照组相比,转染重质粒后1-5天, SGC7901细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01),细胞形成克隆数明显降低(P＜0.01),并且有明显的亚二倍体峰出现(P＜0.05).结论:针对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞SGC7901 midkine表达,细胞增殖及克隆形成能力减弱,细胞凋亡增加,为midkine 基因靶向治疗提供一定的实验依据.     

小干扰RNA靶向MIF对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响#br#

目的探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响。 方法取对数生长期的SGC 7901细胞,采用脂质体法分别转染靶向人MIF的siRNA（siMIF组）或阴性对照序列（NC组）,48 h后采用Western blotting检测MIF蛋白的表达情况,MTT法观察转染后24、48、72 h的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后72 h的细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达变化。 结果siMIF组转染48 h后的MIF相对表达量为0321±0104,低于NC组的1078±0212,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组转染48～72 h后的细胞增殖率低于NC组,差异有统计学意义（P＜005）。转染MIF siRNA 72 h后,siMIF组的细胞凋亡率为（235±36）％,高于NC组的（47±17）％,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组Bcl 2的相对表达量为0663±0209,低于NC组的1129±0178,而Bax相对表达量为0981±0225,高于NC组的0587±0254,以上差异均有统计学意义（P＜005）。 结论siRNA靶向沉默MIF能够降低SGC 7901细胞中MIF蛋白表达,抑制SGC 7901细胞的增殖并促进凋亡,在胃癌的靶向治疗中有一定前景。     

MicroRNA-130a调节胃癌细胞SCG7901/DDP的耐药机制研究

目的:探讨microRNA-130a（miR-130a）在胃癌耐药细胞中的表达,并对进一步作用的机制进行研究。方法:采用体外转染法将miR-130a模拟物或抑制剂分别瞬时转染到SCG7901和SCG7901/DDP细胞后,应用Real-time PCR检测转染前后细胞中miR-130a的表达情况;CCK8实验检测转染前后细胞对顺铂（DDP）敏感性的变化;并用Western blot检测转染前后细胞中PETN的表达变化。结果:MiR-130a在SGC7901／DDP中的表达水平是SGC7901细胞的（8.33±1.21）倍（P＜0.01）。SGC7901转染miR-130a mimics后,细胞中miR-130a表达水平是转染前的（5.52±1.65）倍（P＜0.01）,DDP对SGC7901增殖的抑制率较转染前明显下降（P＜0.01）,细胞内PTEN表达水平较转染前明显下降（P＜0.01）。SCG7901/DDP在转染miR-130a inhibitor 后,细胞中miR-130a表达水平是转染前的（0.18±0.04）倍（P＜0.01）,DDP对SCG7901/DDP增殖的抑制率与转染前比较明显增加（P＜0.01）,细胞内PTEN表达水平较转染前明显增高（P＜0.01）。结论:MiR-130a通过下调PTEN的表达来调节胃癌细胞对DDP的耐药。     

下调CACNA2D1对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调CACNA2D1对胃癌耐药性细胞系SGC7901/ADR耐药的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测16对胃癌及癌旁组织以及胃癌细胞系SGC7901和SGC7901/ADR中的CACNA2D1 的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测CACNA2D1的蛋白表达情况;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染CACNA2D1 siRNA后SGC7901/ADR的IC50值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR结果显示:CACNA2D1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01);CACNA2D1在耐药细胞系SGC7901/ADR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901(P＜0.01)。蛋白免疫印迹技术结果显示相对于转染CACNA2D1 negative control（NC）组,转染CACNA2D1 siRNA组的胃癌细胞CACNA2D1表达降低;MTT结果显示细胞系SGC7901与SGC7901/ADR的阿霉素半数抑制浓度（IC50）分别为（1.3±0.6）μg/ml与（5.5±0.45）μg/ml;SGC7901/ADR转染CACNA2D1 siRNA后对阿霉素的IC50明显下降。流式细胞术检测凋亡结果显示,CACNA2D1的表达下调后,SGC7901/ADR细胞的凋亡比明显增加。 结论:CACNA2D1能够促进胃癌SGC7901/ADR细胞系产生多药耐药。     

小干扰RNA靶向MIF对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响#br#

目的探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响。 方法取对数生长期的SGC 7901细胞，采用脂质体法分别转染靶向人MIF的siRNA（siMIF组）或阴性对照序列（NC组），48 h后采用Western blotting检测MIF蛋白的表达情况，MTT法观察转染后24、48、72 h的细胞增殖情况，流式细胞仪检测转染后72 h的细胞凋亡率，Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达变化。 结果siMIF组转染48 h后的MIF相对表达量为0321±0104，低于NC组的1078±0212，差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组转染48～72 h后的细胞增殖率低于NC组，差异有统计学意义（P＜005）。转染MIF siRNA 72 h后，siMIF组的细胞凋亡率为（235±36）％，高于NC组的（47±17）％，差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组Bcl 2的相对表达量为0663±0209，低于NC组的1129±0178，而Bax相对表达量为0981±0225，高于NC组的0587±0254，以上差异均有统计学意义（P＜005）。 结论siRNA靶向沉默MIF能够降低SGC 7901细胞中MIF蛋白表达，抑制SGC 7901细胞的增殖并促进凋亡，在胃癌的靶向治疗中有一定前景。     

RNA干扰卷曲螺旋结构域蛋白34表达对膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨卷曲螺旋结构域蛋白34（CCDC34）的表达对膀胱癌细胞生物学行为包括增殖、凋亡、克隆形成和侵袭能力的影响。方法 选取膀胱癌5637细胞分别转染阴性对照siRNA（阴性对照组）和CCDC34 siRNA（CCDC34干扰组）慢病毒载体,荧光显微镜观察慢病毒感染效率;实时荧光定量PCR和Western blotting验证CCDC34的干扰效率;BrdU掺入实验、流式细胞术、克隆形成实验和Transwell小室侵袭实验检测干扰CCDC34表达对5637细胞增殖、凋亡、克隆形成及侵袭能力的影响。结果 阴性对照组与CCDC34干扰组的慢病毒感染效率均在85％以上。与阴性对照组相比,感染CCDC34 siRNA的细胞中CCDC34 mRNA表达水平受到显著抑制（1.00±0.06 vs. 0.16±0.01,P＜0.01）,且CCDC34蛋白表达下降。BrdU实验显示,CCDC34干扰组的细胞增殖能力较阴性对照组受到显著抑制（P＜0.05）,且细胞凋亡显著增加［（28.09±0.39）％ vs.（9.50±0.01）％,P＜0.01）］。克隆形成实验显示,CCDC34干扰组的克隆形成能力显著低于阴性对照组（22±4 vs.310±5,P＜0.01）。Transwell小室侵袭实验显示,CCDC34干扰组膀胱癌细胞的侵袭转移率显著低于阴性对照组（0.53±0.03 vs.2.58±0.10,P＜0.01）。结论 慢病毒介导的RNA干扰技术可下调CCDC34蛋白在膀胱癌5637细胞中的表达,并显著抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力;CCDC34有望成为膀胱癌的生物标记物和治疗的新靶点。     

Rab11对子宫颈癌HeLa细胞生物学功能的影响

目的：通过调控Rab11在子宫颈癌HeLa细胞中的表达,观察Rab11对子宫颈癌HeLa细胞生物学功能的影响。方法将Rab11 siRNA转染至HeLa细胞,Western blot法检测Rab11蛋白表达变化,以转染阴性对照siRNA细胞为对照组,采用CCK8、克隆实验、EdU实验、Transwell小室法体外检测转染后的HeLa细胞增殖能力、侵袭能力的变化。结果与对照组比较,HeLa细胞转染Rab11 siRNA组Rab11蛋白表达明显下调（1.096±0.091比1.735±0.084,P＜0.01）。与对照组比较,转染Rab11 siRNA组HeLa细胞增殖受抑制（吸光度值48 h：0.721±0.092比1.090±0.099;72 h：0.956±0.105比1.482±0.096;96 h：1.231±0.099比1.720±0.174,P＜0.01）,克隆形成数减少[（36±1）个比（75±8）个, P＜0.01],增殖率降低[（33.880±1.902）%比（45.570±2.025）%,P＜0.05]。Rab11 siRNA转染组较对照组侵袭率降低[（38.6±0.8）%比（100.0±0.2）%,P＜0.01]。结论体外实验证实Rab11表达下调能够抑制HeLa细胞的生长。     

沉默mGluR5对卵巢癌SKOV3细胞生物学特性的影响及其机制研究

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及可能的机制。方法 采用靶向mGluR5表达的特异siRNA 转染卵巢癌SKOV3细胞（转染组）,同时设置转染无义序列的阴性对照组。转染48 h,采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测siRNA对mGluR5的沉默效果;采用CCK-8法、EdU细胞荧光染色实验、Hoechst 33342细胞染色实验、划痕实验检测沉默mGluR5表达后SKOV3细胞的活性、增殖、凋亡和迁移情况;采用Western blotting检测PTEN／Akt信号通路相关蛋白的表达情况。结果 QPCR检测显示,转染组中mGluR5 mRNA的表达水平降至（18.3±2.3）％,显著低于阴性对照组（P＜0.05）。CCK-8法检测显示,转染72 h阴性对照组的吸光值为4.1±0.2,高于转染组的2.4±0.3（P＜0.05）。EdU免疫荧光染色实验显示,转染48 h阴性对照组的细胞增殖率为（22.4±2.3）％,高于转染组的（9.2±1.2）％（P＜0.05）。Hoechst 33342细胞染色实验显示,转染48 h阴性对照组的细胞凋亡率为（6.2±1.3）％,低于转染组的（28.2±2.2）％（P＜0.05）。划痕实验显示,阴性对照组的相对划痕愈合比例为（100.0±2.1）％,显著高于转染组的（48.6±4.3）％（P＜0.05）。Western blotting检测显示,转染组PTEN蛋白的表达增加,p-Akt蛋白的表达降低（P＜0.05）;而Akt蛋白无明显变化（P＞0.05）。结论 沉默mGluR5表达能显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进凋亡,降低细胞迁移能力,该过程可能与激活PTEN／Akt信号通路有关。     

白藜芦醇逆转胃癌细胞对阿帕替尼耐药性的实验研究

目的 探讨白藜芦醇（RES）在胃癌细胞对阿帕替尼耐药性中的影响及可能机制。方法 体外培养胃癌SGC7901细胞和SGC7901／AR耐药细胞,MTT法和划痕实验检测单药不同浓度阿帕替尼或联合RES对SGC7901和SGC7901／AR细胞增殖和迁移的影响,分别计算SGC7901和SGC7901／AR细胞耐药指数、RES的逆转倍数（RF）和相对逆转率（RRR）。采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测上述处理细胞株中miR-122、p-VEGFR2、p-Akt mRNA表达。结果 阿帕替尼显著抑制SGC7901细胞的增殖和迁移能力,并呈浓度依赖性（P＜0.05）,但对SGC7901／AR细胞无影响,耐药指数为15.57;阿帕替尼联合50.0 μmol／L RES可显著抑制SGC7901和SGC7901／AR细胞的增殖和迁移能力,并呈浓度依赖性（P＜0.05）,耐药指数为2.13,RES的逆转倍数为7.91倍,相对逆转率为93.4％。未经处理SGC7901细胞中miR-122、p-VEGFR和p-Akt mRNA表达水平分别为0.74±0.11、0.76±0.13和0.67±0.09,显著高于SGC7901／AR细胞（P＜0.05）;经10 μmol／L阿帕替尼作用后,SGC7901细胞中p-VEGFR2和p-Akt mRNA表达水平显著下降（P＜0.05）。经10 μmol／L阿帕替尼+50.0 μmol／L RES处理后,SGC7901和SGC7901／AR细胞中miR-122表达显著升高（P＜0.05）,而p-VEGFR2和p-AktmRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。结论 RES能逆转胃癌细胞株对阿帕替尼的耐药性,其机制可能通过上调miR-122并抑制VEGFR2和Akt磷酸化水平来实现。     

miR-486-5p对胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响

背景与目的：既往研究表明微小RNA-486-5p(miR-486-5p)在多种肿瘤的进展中起重要作用,但其在胃癌中作用的研究较少,本研究旨在探讨miR-486-5p对胃癌细胞株SGC7901增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法：使用实时定量PCR(quantification real-time PCR,qRT-PCR)检测胃癌细胞株SGC7901及胃黏膜上皮细胞GES-1中miR-486-5p的表达,构建miR-486-5p过表达质粒,使用脂质体法瞬时转染胃癌细胞株SGC7901,qRT-PCR检测转染细胞后miR-486-5p的表达丰度,噻唑蓝(MTT)法及流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡情况,Transwell小室迁移实验检测细胞的迁移能力。结果：miR-486-5p在SGC7901细胞中表达明显下调,SGC7901细胞转染miR-486-5p过表达质粒后,miR-486-5p表达明显上调,细胞增殖、迁移能力降低,凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-486-5p可抑制胃癌细胞株SGC7901的增殖和迁移。     

siRNA沉默Snail基因对胃癌SGC7901细胞株增殖及侵袭能力的影响

目的探讨转录因子Snail在胃癌SGC7901细胞株增殖及侵袭转移过程中的作用,为胃癌的基因治疗提供有效靶点。方法化学合成针对Snail的靶向siRNA,同时以转染阴性对照siRNA、转染脂质体转染试剂和空白细胞作为对照。RT-PCR检测转染效率,MTT检测Snail siRNA对SGC7901细胞增殖能力的影响,Boyden chamber检测Snail siRNA对SGC7901细胞侵袭能力的影响。结果与各对照组相比,转染SnailsiRNA组SGC7901细胞Snail mRNA的表达下降,且随转染时间延长,Snail mRNA的表达下降明显(P<0.05)。MTT结果显示转染Snail siRNA组SGC7901细胞在转染后48、72 h较对照组增殖能力明显下降(P<0.05);Boyden chamber结果显示转染Snail siRNA组SGC7901细胞在转染后48、72 h较对照组穿膜细胞数明显下降(P<0.05);转染Snail siRNA组各时间点之间增殖能力和侵袭转移能力的差异也有统计学意义(P<0.05)。结论转录因子Snail在胃癌的发生、发展及侵袭转移中发挥重要作用,可作为胃癌基因治疗的有效靶点。     

miR-9-5p靶向FGF9抑制胃癌细胞迁移侵袭的作用机制

目的:探讨miR-9-5p在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞株SGC7901、AGS细胞迁移和侵袭影响的作用机制。方法:real-time PCR和Western blot检测癌旁组织、胃癌组织及其细胞系中miR-9-5p和FGF9的表达；Transwell小室检测过表达miR-9-5p或敲除FGF9对SGC7901和AGS细胞迁移和侵袭能力的影响；TargetScan在线分析、双荧光素酶报告基因和Western blot实验验证miR-9-5p和FGF9的靶向关系；将转染后的SGC7901细胞分为对照（NC）组和实验（miR-9-5p）组接种于裸鼠右侧腋窝皮下，观察记录裸鼠成瘤情况并绘制生长曲线。结果:与癌旁组织相比，胃癌组织及其细胞系中miR-9-5p表达下调、FGF9表达上调（P＜0.05）；过表达miR-9-5p或敲除FGF9能抑制SGC7901、AGS细胞迁移和侵袭；TargetScan在线分析、双荧光素酶报告基因和Western blot实验表明miR-9-5p能调控FGF9表达；miR-9-5p组细胞成瘤速度较NC组慢（P＜0.05），肿瘤体积及重量小（P＜0.05）。结论:miR-9-5p在胃癌组织中表达下调，过表达miR-9-5p可抑制FGF9表达，从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，减缓肿瘤生长。     

下调EZH2基因对胃癌细胞株SGC7901增殖作用的影响

目的 探讨下调EZH2基因对胃癌细胞株SGC7901的增殖作用,研究EZH2基因在胃癌发生发展中的作用.方法 针对EZH2基因序列设计合成小干扰RNA片段(siRNA)及无效序列片段,将EZH2 siRNA转染至胃癌细胞株SGC7901中作为干扰组,以转染无效序列片段作为阴性对照组,以未作任何处理组作为空白对照组,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EZH2基因下调后EZH2 mRNA的表达,采用Western blot法检测EZH2蛋白表达量,采用CCK-8法检测细胞增殖的活性.结果 成功转染EZH2 siRNA至胃癌SGC7901细胞,干扰组的EZH2 mRNA和蛋白相对表达量较阴性对照组及空白对照组下降,且干扰组细胞增殖受到抑制.结论 下调EZH2基因的表达,使胃癌细胞增殖受到抑制,说明EZH2基因在胃癌细胞的增殖发展进程中有很重要的意义,为深入研究胃癌基因治疗提供一定的理论依据.