小麦AGPase胞质型基因LSUI的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出AGPase胞质型大亚基基因(large subunit,LSU I)的cDNA全长(1947 bp,GenBank No.DQ839506),同源性比较结果表明,与GenBank上已报道的LSU I基因同源性达99%,虽与其有2处碱基不同(与Z21969相比,分别在851 bp处的T变为C和926 bp处的G变为A),但他们的氨基酸序列相同,故不影响其功能.以pBI121质粒为基础,通过中间载体pBSK,构建了由35S启动子调控的LSU I基因的正义表达载体pBI121LSUⅠS;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSU I的反义表达载体pBI121LSUⅠA.同时还克隆出LSU I基因的250 bp片段,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGCLsuⅠ,这为研究该基因的功能打下了很好的基础.     

小麦AGPase胞质型基因LSUⅠ的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出AGPase胞质型大亚基基因(large subunit,LSUⅠ)的cDNA全长(1947 bp,GenBank No.DQ839506),同源性比较结果表明,与GenBank上已报道的LSUⅠ基因同源性达99%,虽与其有2处碱基不同(与Z21969相比,分别在851 bp处的T变为C和926 bp处的G变为A),但他们的氨基酸序列相同,故不影响其功能.以pBI121质粒为基础,通过中间载体pBSK,构建了由35S启动子调控的LSUⅠ基因的正义表达载体pBI121LSU Ⅰ S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSUⅠ的反义表达载体pBI121LSU Ⅰ A.同时还克隆出LSUⅠ基因的250 bp片段,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGCLsuⅠ,这为研究该基因的功能打下了很好的基础.     

芸薹属TT19基因家族RNA干扰载体的构建

为构建芸薹属TT19基因家族的RNAi载体,为芸薹属植物的种皮色素、观赏色彩等性状的研究和修饰打基础.利用PCR克隆芸薹属TT19基因家族的RNAi片段,采用双酶切将其反义片段和正义片段分别从T-载体亚克隆到平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间和间隔区与终止子之间,形成RNAi载体,转化大肠杆菌并完成PCR鉴定,再转化根癌农杆菌LBA4404得到工程菌株.结果表明:克隆得到200 bp(含人工酶切位点)的芸薹属TT19基因家族RNAi片段BTT19I,其对应于甘蓝型油菜BnTT19-1 mRNA的363～540 bp,其反义和正义片段分别被NcoI+AatII和BamHI+XbaI双酶切亚克隆到pFGC5941M中,得到10552 bp的RNAi载体pFGC5941M-BTT19I(简称pBTT19I).成功构建了芸薹属TT19基因家族的RNAi载体.     

柑橘CsERF1基因RNAi载体的构建及转化

用RT-PCR克降柑橘的CsERF1基因cDNA序列,并连接到TA克隆载体pMD-19T上;经限制性内切酶2次双酶切,CsERF1基因的正、反向片段被分别插入到双元质粒pFGC5941查耳酮合成酶A(CHSA)内含子的两端,构成反向重复序列;经菌液PCR和测序验证,成功构建了Cs ERF1基因的RNA干涉载体;通过农杆...     

芸薹属查尔酮合酶基因家族RNA干扰载体的构建

采用PCR法克隆芸薹属CHS基因家族的RNAi片段,经T-载体克隆并测序后,用特定的双酶切方案将其反义片段、正义片段分别亚克隆到平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成RNAi载体,转化大肠杆菌,完成复合PCR鉴定,然后转化根癌农杆菌。结果表明:经测序,以甘蓝型油菜BnCHS1基因为模板克隆的芸薹属CHS基因家族的RNAi片段BCHSI为831 bp,采用Nco+Aat和BamH+Xba分别将其反义和正义片段亚克隆到pFGC5941M中;经复合PCR鉴定,11 814 bp的RNAi载体pFGC 5941M-BCHSI(简称pBCHSI)构建成功,并获得了根癌农杆菌LBA4404的工程菌株。芸薹属CHS基因家族RNAi载体的成功构建,将促进甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种类黄酮性状的研究与修饰。     

芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建

二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种皮色素和茎叶彩色性状的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

真核表达质粒pIRES-ST3GAL Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的初步表达

构建β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GALI)基因的真核表达载体p IRES-ST3GALI,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达。以p GEM-ST3GALI质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增ST3GAL I基因,通过酶切和连接,构建真核表达载体p IRESST3GALI。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化筛选阳性重组大肠杆菌(DH5α),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,并用12%SDS-PAGE鉴定。结果表明,重组质粒p IRES-ST3GAL I中的ST3GAL I序列与原鸡的ST3GAL I氨基酸序列同源性98.8%,与猪的同源性达53.5%,与人的同源性达52.6%。β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I在大肠杆菌中实现了良好的表达。本试验已成功构建了含有β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的真核表达载体p IRES-ST3GAL I,为其转染传代细胞建立重组传代细胞系奠定了基础。     

[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的转化与筛选

为获得转基因抗虫玉米,将[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因导入玉米,并进行鉴定和筛选。在[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的两端分别添加Nco I和Bam H I酶切位点,并进行人工合成。将EβF合成酶基因与植物表达载体p FGC5941连接,经双酶切和测序鉴定。结果表明:重组表达载体p FGC5941-EβF构建成功;载体p FGC5941-EβF转化农杆菌EHA105后用玉米芽尖侵染法将EβF合成酶基因导入玉米自交系郑58中,对转化植株进行除草剂抗性筛选以及EβF合成酶基因和bar基因的PCR鉴定后,共得到18株转基因阳性植株。     

重组人表皮生长因子(hEGF)植物表达载体的构建(英文)

[目的]构建重组人表皮生长因子的植物用表达载体,为应用花生毛状根表达系统表达人表皮生长因子(hEGF)奠定基础。[方法]在GenBank中找到hEGF基因序列,并人工合成;将含hEGF基因与绿色荧光蛋白(GFP)的基因连接,用加相应接头的引物扩增得到这2个基因的片段,然后用Sal I和EcoR I的进行双酶切并回收;提取质粒pRI 101 AN DNA,并用Sal I和EcoR I对其进行双酶切并回收,再次将经过双酶切的2个DNA片段连接,将连接产物转化大肠杆菌XL10-Gold,再提取得到的发荧光重组子质粒的DNA,用酶切图谱和PCR进行鉴定,将验证正确的重组子中的质粒DNA命名为pBZG101。[结果]hEGF和GFP连接成功,并成功地将这2个基因连接的片段连接至质粒pRI 101 AN DNA上,得到了重组人表皮生长因子的植物用表达载体pBZG101。[结论]该研究成功构建了重组人表皮生长因子的植物用表达载体pBZG101。     

烟草Bex inhibitor-1基因植物沉默表达载体的构建及对农杆菌的转化

试验首先对质粒pGSA1285进行改造,将pFGC5941质粒的查尔酮合酶的Intron片段取代pGSA1285的GUS片段,构建含有内含子并具有卡那抗性的pGSA2285植物沉默表达载体。同时设计引物、PCR扩增、在BI-1基因两端各加上两个酶切位点,将BI-1基因分别反向、正向插入改造后的质粒pGSA2285Intron片段两端的多克隆位点中,构建得到烟草BI-1基因沉默载体pGSA4285。此沉默质粒经PCR鉴定、限制性酶切分析以及回复动员试验证明已正确构建并成功转入农杆菌,为获得含有BI-1基因沉默烟草植株及其在植物程序性死亡中调控作用的研究奠定试验基础。     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达(摘要)(英文)

[目的]构建小麦热激蛋白60(HSP60)基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦HSP60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90kD。蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果表明,表达的蛋白条带与预期大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coliBL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建

通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。     

Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因表达文库的构建

为构建用于筛选Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因的融合基因表达文库.采用自杀载体pGP704为骨架,将无启动子的cat基因作为报告基因克隆到自杀载体pGP704上,构建报告质粒pGP704-cat;将Ⅱ型猪链球菌基因组DNA的500～1 000 bp酶切片段克隆到报告质粒pGP704-cat中cat基因的上游,转化受体菌获得融合基因文库;将文库质粒电转化Ⅱ型猪链球菌,得到融合基因表达文库.结果表明:构建的融合基因表达文库以氯霉素作为选择标记,经体外培养,获得2%的菌株具有氯霉素抗性,融合基因表达文库存在可以启动cat基因表达的启动子序列,cat基因在体外可以表达.构建的融合基因表达文库可以用于Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因的筛选.     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析(英文)

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行其序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并通过DNAman、NCBI Blast、ExPASy ProtParam等工具,对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。由SS基因翻译出来的蛋白质分子量为47.8394KDa,理论等电点为8.57,无信号肽。疏水性分析表明,在400~417区域疏水性较强。跨膜区分析表明有3处跨膜区域,分别为170～186位的17个氨基酸、282～305位的24个氨基酸、387～407位的21个氨基酸。通过NCBI的BLAST程序分析指出,该基因编码的氨基酸序列含有Trans_IPPS_HH的保守区域,也具有与Mg2+结合有关的活性中心——富含天门冬氨酸的区域(DXXDD)。2级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

保卫细胞中特异表达启动子片段缺失后表达载体的构建

iMyAP基因启动子的核心启动子370 bp片段能启动基因在保卫细胞中特异性表达。将其进行缺失,克隆得到370 bp、308bp和150 bp的启动子片段,与pMD18-T载体连接并进行序列分析后用BLAST软件作同源分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登陆的iMyAP启动子片段的核苷酸序列一致。将这3个启动子片段分别与pCAMBIA-1303质粒相连,构建得到表达载体。     

草莓多酚氧化酶基因全长的克隆及表达载体构建

【目的】为了提高草莓的果实品质和经济价值。【方法】利用改良CTAB法提取五叶草莓叶片总DNA,反向PCR(IPCR)方法克隆基因。【结果】得到了2条完整的草莓多酚氧化酶基因全长3 591bp和1 809bp,分别编码1 196和602个氨基酸,分别命名为FpPPO1与FpPPO_2,GenBank登录号分别为HM063946和HM063947。FpPPO1和FpPPO_2与其他物种中的多酚氧化酶基因比较,氨基酸相似性分别为57%~77%与74%~99%。最后成功构建了多酚氧化酶基因反义植物表达载体pCP430和正义植物表达载体pCP1809。【结论】克隆得到草莓FpPPO1和FpPPO_2基因全长并构建转基因载体,为研究草莓中多酚氧化酶基因的功能奠定了基础。     

Cloning of TaCYP707A1 Gene that Encodes ABA 8'-Hydroxylase in Common Wheat (Triticum aestivum L.)

The plant hormone abscisic acid (ABA) regulates many important physiological and developmental processes in plants.The objective of this study was to clone the ABA 8'-hydroxylase gene in common wheat. In the present study, we used the cDNA sequence of barley HvCYP707A1 gene (GenBank accession no. AB239299) as a probe for BLAST search against the common wheat (Triticum aestivum L.) EST database in GenBank. All wheat ESTs sharing high similarity with the reference gene were subjected to contig assembly. Primers were designed based on the constructed contigs to clone the wheat CYP707A1 gene, designated as TaCYP707AI. The genomic DNA sequence of TaCYP707A1 gene comprised five exons and four introns, with a size of 2 225 bp. The corresponding cDNA sequence of TaCYP707A1 was 1 737 bp,containing an open reading frame (ORF) of 1 431 bp, a 42-bp 5'-untranslated region (UTR) and a 264-bp 3'UTR, with 94.9% of identical sequences to HvCYP707A1 gene (AB239299). The neighbor joining tree indicated that the deduced amino acid sequences of TaCYP707A1 gene was highly similar to those of barley and rice. The TaCYP707A1 gene was located on chromosome 6BL using a set of Chinese Spring nullisomic-tetrasomic lines and ditelosomic line 6BS. These results will be of high importance in understanding of molecular mechanism of ABA catabolism.