埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配

目的：制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法：根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经lipofectamine2000转染293FT细胞;以Western blot检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。结果：构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。结论：在293FT细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒（pLP1、pLP2）、包膜质粒（pLP/VSVG）共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3＂细胞后,Western印迹法检测293FI＂细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配

为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1。将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1。用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达。通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs)。用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs。结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs。     

pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒构建及其在人成骨样细胞SaOS-2细胞中的表达*

目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)的pcDNA3.1(+)真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-CTGF),并检测其在人成骨样细胞SaOS-2中的表达,为进一步研究CTGF基因在骨发育和骨修复中的机制提供技术支撑。方法:采用PCR方法体外克隆CTGF基因全序列,将其用同源重组技术连接到线性pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并对该质粒进行测序鉴定;鉴定无误后转染至SaOS-2细胞中,观察其48 h的表达情况。结果:基因测序证实pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达重组质粒构建成功,与对照组相比,转染SaOS-2细胞48 h后的CTGF表达水平显著上调,达到对照组的4.8×10⁵倍(P＜0.01)。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并能在人成骨样细胞SaOS-2中稳定表达,为深入研究CTGF基因对骨生成的调控机制奠定了基础。     

人Rab12基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

Rab蛋白参与细胞的囊泡运输过程。自噬体-溶酶体的融合需要活化的Rab12蛋白参与。本研究从HEK293细胞获取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Rab12基因的ORF全序列,将其克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-N1上,成功构建重组质粒pEGFP-Rab12,然后采用lipofectamine 2000将重组质粒转染至HEK293细胞中并获得高表达。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析

利用含有强启动子P_AOX1 和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,分泌于胞外的PST蛋白分子量比天然PST分子量稍大 ,而胞内的PST蛋白分子量与天然PST大小相同。将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST再次转化重组酵母细胞X 33 pPICZαA pST(Mut⁺) ,所得表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果显示 ,PST基因的表达水平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原 抗体结合反应 ,表达量达 95 6mg L。将发酵液上清进行N 糖基化分析 ,显示rPST无N 糖基化加工修饰     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

鸡neurexophilin 1基因在毕赤酵母中的表达

Neurexophilin 1是母鸡子宫阴道结合部位的差异表达基因。根据鸡nxph1的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成nxph1基因,设计引物以合成基因为模板,扩增其去除信号肽的DNA序列△nxph1,将合成的nxph1基因及去除信号肽的nxph1基因片段△nxph1分别插入pPICZαA真核表达载体,构建重组表达质粒pPICZαA/nxph1和去除信号肽的重组表达质粒pPICZαA/△nxph1,电转入毕赤酵母GS115,阳性菌用终浓度为1%的甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测表达产物,结果表明重组菌成功分泌鸡NXPH1蛋白和去除信号的△NXPH1蛋白,大小约29 kD,为探索NXPH1在母鸡生殖道内的功能奠定基础。     

自噬抑制肿瘤坏死因子α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞发生凋亡

目的:探讨TNF-α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞(hfPMSCs)发生凋亡和自噬的作用,以及自噬对细胞凋亡的调控作用。方法:利用流式细胞术检测无血清培养hfPMSCs中CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达;用终浓度20μg/L的TNF-α处理hfPMSCs 24h,以未处理细胞作为对照组。Annexin V/PI双染色检测TNF-α对hfPMSCs凋亡程度的影响;分别提取各组总蛋白,Western blot检测自噬标志基因LC3Ⅰ/Ⅱ的表达;利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞,观察胞内点状聚集形成的情况;利用Atg5干扰慢病毒(si-Atg5)及阴性对照慢病毒(si-NC)感染hfPMSCs,Annexin V/PI双染色检测TNF-α对慢病毒感染后hfPMSCs凋亡程度的影响。结果:所培养细胞具有典型的MSCs形态,呈CD73~+CD90~+CD105~+/CD14~-CD34~-CD45~-细胞; Annexin V/PI染色结果显示,TNF-α作用24 h后,hfPMSCs凋亡数和凋亡率均高于对照组(P 0. 05);Western blot检测自噬标志蛋白表达结果表明,TNF-α可增加LC3Ⅱ的表达(P 0. 05);荧光共聚焦显微境观察到TNF-α可显著提高细胞中的点状聚集。利用si-Atg5感染细胞,抑制hfPMSCs自噬的发生,与对照慢病毒si-NC感染细胞比较,可显著促进TNF-α诱导hfPMSCs凋亡的发生(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导的自噬抑制人胎盘胎儿来源MSCs凋亡的发生,具有一定的保护性作用。     

Co-expression of IL-18 binding protein and IL-4 regulates Th1/Th2 cytokine response in murine collagen-induced arthritis

We constructed a recombinant adenoviral vector containing a murine interleukin （IL）-18 binding protein （mlL-18BP） and murine IL-4 （mIL-4） fusion gene （AdmIL-18BP/mIL.4） and used a gene therapy approach to investigate the role of IL-18BP and IL-4 in modulating the T-helperl and T-helper2 （Th1/Th2） balance in mice with collagen-induced arthritis （CIA）. Mice with CIA were intra-articularly injected with 107 pfu/6 μl ofeitherAdmIL.18BP/mIL-4, or a controladenovirus, or with the control vehicle （phosphate-buffered saline）. After intra-articular gene therapy with AdmIL-18BP/mIL-4, the serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）, T-interferon （IFN-γ）, IL-4, IL-10, and IL-18 in mice with CIA were assessed by ELISA. IFN-T-expressing and IL-4-expressing CD4^＋ T cells from mice splenocytes were monitored by flow cytometry. Mice with CIA at weeks 1, 2, and 4 after intraarticular injection of AdmIL-18BP/mIL-4 showed significantly increased serum concentrations of IL-4 and IL-10 （P〈0.01 at all time points） but greatly decreased serum concentrations ofIFN-γ, TNF-α and IL-β （P〈0.01 at all time points ） compared to both the con trol adenovirus and phospha tebuffered saline control groups. The percentage of LFN-γ- producing CD4^＋ T cells was significantly decreased in response to local AdmIL-18BP/mIL-4 treatment. The percentage of IL-4-producing CD4^＋ T cells increased significantly at 1 week after local injection of AdmIL-18BP/ mIL-4 then returned to normal by week 4. These data indicated the significant modifying effects on the Th1/Th2 imbalance in murine CIA produced by local overexpression of IL-18BP and IL-4. Combination treatment with IL-18BP and IL-4 is a promising potential therapy for rheumatoid arthritis.     

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

目的构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,转染人宫颈癌Hela细胞,用以探讨HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用。方法应用基因重组技术构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,通过脂质体介导将其转染入Hela细胞,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果酶切鉴定结果显示含EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建成功,并能在Hela细胞中封闭HIF-1α蛋白的表达。结果 EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建及转染成功,封闭Hela细胞中HIF-1α蛋白的表达,为进一步研究HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用提供试验基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在昆虫细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High FiveTM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度gE蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。结果:构建了pFastbac-VZV g E1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达gE蛋白且随着病毒代次升高g E蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的gE蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的gE抗原结合。结论:成功获得了杆状表达系统表达的gE蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。     

小檗碱对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及免疫机制*

目的:探讨小檗碱对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及免疫机制。方法:50只SD大鼠随机分为假手术组(Sham group)、模型组(Model group)、小檗碱低剂量组(BBR-L,25 mg/kg)、小檗碱中剂量组(BBR-M,50 mg/kg)、小檗碱高剂量组(BBR-H,100 mg/kg),每组各10只。采用Longa线栓法建立脑缺血/再灌注大鼠模型,缺血2 h后再灌注24 h处理。于造模成功2 h后灌胃给药,假手术组和模型组组按上述方法同体积给予生理盐水。给药24 h后,测定各组大鼠神经功能缺损程度评分及脑梗死率;采用ELISA法检测抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性、细胞因子TNF-α、IFN-β、IL-6和NO的含量;采用流式细胞术检测CD4⁺、CD8⁺及CD4⁺/CD8⁺血清含量;进一步采用RT-qPCR与Western blot技术检测大鼠脑组织内NF-κB-NLRP3信号轴关键基因及蛋白的表达情况。结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损程度、脑梗死率均升高(P＜0.05),且血清NO、TNF-α、IFN-β、IL-6含量和脑组织的NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1基因与蛋白表达水平均升高(P＜0.05),而血清中SOD、GSH-Px活性和CD4⁺、CD8⁺及CD4⁺/CD8⁺水平下降(P＜0.05);与模型组比较,BBR-H、BBR-M、BBR-L组大鼠神经功能缺损程度、脑梗死率均下降(P＜0.05),且血清NO、TNF-α、IFN-β、IL-6含量和脑组织的NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1基因与蛋白表达水平均降低(P＜0.05),而血清中SOD、GSH-Px活性和CD4⁺、CD8⁺及CD4⁺/CD8⁺水平升高(P＜0.05)。结论:小檗碱可通过减轻氧化应激,抑制炎症反应,增强免疫功能,减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤,其机制可能与抑制NF-κB-NLRP3信号有关。     

靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的：构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1d表达的Hela229稳定细胞系.方法：根据shRNA的设计原则,以IL-1 αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果.结果：经酶切鉴定和测序分析确定IL-1 α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1 α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株.结论：靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系.     

冠状病毒HCoV-229E S1蛋白片段的免疫原性分析

目的表达和纯化HCoV-229E的S1蛋白片段（S1 417-547）,分析其诱导的免疫应答。方法将纯化蛋白免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及血清IL-4和IFN-γ含量,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布,观察其诱导的免疫应答。结果表达蛋白经金属螯合获得纯化,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体。脾脏CD4^＋和CD8^＋比例均升高,CD4^＋/CD8^＋比值下降;免疫鼠血清IFN-γ和IL-4水平显著升高。结论成功构建了HCoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,表达蛋白免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

28例急性巨核细胞白血病实验室检查结果分析

目的:分析急性巨核细胞白血病(AMKL)患者实验室检查特点。方法:4管用8色抗体组合对28例AMKL患者的骨髓有核细胞进行免疫表型分析,同时结合分析患者骨髓细胞形态学、融合基因和染色体核型等检查结果。结果:28例AMKL患者中阳性表达率较高的是巨核细胞相关抗体:CD41a、CD61、CD42b、CD36,阳性率分别为81. 48%、92. 86%、72. 00%、70. 83%,其中,CD41a、CD61、CD42b三种抗体共表达的患者占53. 57%,至少表达两种抗体的患者占82. 14%。髓系祖细胞相关标志:CD117、CD34、CD38、HLA-DR阳性表达率分别为64. 29%、42. 86%、64. 29%和46. 15%,与非APL的AML患者相比表达率均较低(P 0.01);髓系全程抗原CD13、CD33在AMKL中阳性表达率与非APL的AML之间无统计学差异。髓系中后期抗原CD15及单核系抗原CD64、CD14、CD300e和胞浆抗原MPO、cCD79a和cCD3均阴性。与非Down综合征相关AMKL(non-DS-AMKL)相比,CD7与CD11b的表达在Down综合征相关AMKL(DS-AMKL)中较高(P 0.05)。AMKL患者中17例(65.4%)为复杂染色体核型,5例为+21染色体异常;仅5例患者核型正常。25例行白血病融合基因筛查,24例(96%)患者WT1基因表达增高(40.24±59.14%),12例患者(70.58%) EVI1基因表达增高(53.93±37.98%),4例患者融合基因阳性(2例MLL-AF9阳性,1例TLS-ERG,1例P210 BCL/ABL)。结论:AMKL中82.14%患者表达至少两种巨核细胞相关标志,髓系祖细胞标志表达相对较低,多为复杂染色体核型异常,WT1及EVI1异常表达率较高。