玉米AGPase-bt2与GPN1蛋白互作的双分子荧光互补技术研究

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-AGPasebt2、326-CYNEE-GPN1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;携带有共转化基因的烟草叶肉细胞在激光共聚焦显微镜下观察到明显的黄色荧光现象,且黄色荧光与叶绿体自发的红色荧光位置重合。【结论】AGPase-bt2与GPN1在植物细胞中真实地存在蛋白互作。     

双分子荧光互补技术（BiFC）分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。     

双分子荧光互补技术（BiFC）分析玉米 MAPK5与 bZIP72蛋白的相互作用

[目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与Zmb ZIP72的Bi FC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞,细胞核中能发出黄色荧光。[结论]Zm MAPK5与Zmb ZIP72在植物细胞核内相互作用。     

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

[目的]获得高产量的烟草叶片原生质体.[方法]在前人的基础上,在酶浓度和酶解时间上,对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索;并以此为基础,通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用.[结果]在纤维素酶浓度为1.3％,离析酶浓度为0.4％,果胶酶浓度为0.3％,酶解4h,酶解温度28℃,并在简易纯化的条件下制备原生质体,所得到的完整原生质体产量最高,并且细胞碎片和杂质均最少.[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考.     

红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明,通过对苹果cDNA文库的筛选,共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白;选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验,结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。     

玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。     

双分子荧光互补法（BiFC）精确MICOS复合物精细结构

在真核细胞中,线粒体是能量合成与物质代谢的重要场所。线粒体是双层膜细胞器,内膜向内折叠形成嵴,其中MICOS复合物对于线粒体嵴的形成起着重要作用。Mic60、Mic19和Mic10是MICOS复合物核心组成蛋白。采用双分子荧光互补技术(BiFC,bimolecular fluorescence complementation)方法在活细胞中直接观察研究MICOS复合物中各组成蛋白之间的相互作用关系。发现Mic60可以与Mic19发生较强的相互作用,而Mic60与Mic10的相互作用较弱。     

苔藓与病原真菌互作关系的研究进展

苔藓与病原真菌之间的互作是当今植物病理学研究的热点问题之一，相关的研究有望为植物抗病机制的解析奠定理论基础。我们从遗传基础、生理生化基础、信号传导以及研究工具等方面综述了苔藓与病原真菌互作机制的研究进展。     

猪圆环病毒2型复制酶蛋白的胞内互作蛋白研究进展

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus virus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）以及其他猪相关疾病的主要病原体。复制酶（Replicase,Rep）蛋白是由PCV2 ORF1基因编码的功能性复制启动蛋白,通过与ORF1编码的另一复制相关蛋白Rep′共同作用参与PCV2的DNA滚环复制。Rep蛋白作为PCV2的一种必需功能性蛋白,是研究PCV2抗病毒治疗的一个新突破口。然而,目前有关PCV2致病机理及疫苗的研究大多集中在Cap蛋白,对于Rep蛋白的作用机制研究较少。因此,本文结合国内外近年研究进展,对PCV2 Rep蛋白的胞内互作蛋白进行了系统分析,尤其对现今已发现的8种胞内互作蛋白在PCV2复制过程中可能发挥的重要作用及机制进行了阐释,并对其他可能与PCV2 Rep蛋白存在相互作用的胞内蛋白进行预测,以期为进一步阐明Rep蛋白在PCV2致病中的作用提供理论依据。     

基于Gateway技术的低成本植物双分子荧光互补分析系统

创制基于Gateway重组技术的双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）载体,同时创制低成本低克隆背景的Gateway入门载体。利用入门载体,采用Gateway技术快速将目标基因重组到BiFC目标载体,并采用农杆菌注射侵染烟草的方法观察荧光互作结果。构建的Gateway入门载体,由于带有ccdB基因,非线性化的载体无法在ccdB敏感菌株中生长,因此消除了载体本身的背景。同时由XcmⅠ酶切后产生的T突出,可以很好地与PCR产物结合,连接效率和普通商业化T载体一致。此外,由于载体可由实验室自行制备且采用了TA克隆,创制入门克隆的成本大大降低。借助该研究改造的BiFC目标载体,目的基因能快速地重组到目的载体用于基因互作鉴定。利用本研究构建的Gateway系统,能够以较低成本快速的进行基因克隆和互作研究。     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为100.4%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P0.05)高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断。     

牦牛血抗氧化低聚肽的稳定性及与其他食源性低聚肽抗氧化互作分析

通过菌酶联合法发酵制备牦牛血低聚肽(分子量1 ku),研究其氨基酸组成、热稳定性、酸碱稳定性、金属离子稳定性、冻融稳定性及对食品辅料的稳定性;同时,运用等辐射分析法评价3种食源性低聚肽按不同比例组合后组合肽的抗氧相互作用。结果表明,牦牛血低聚肽具有良好的热稳定性,100℃水浴热处理5 h后的·OH清除活性仍有84.32%。牦牛血低聚肽在pH值为6～10,即高pH值下·OH清除活性几乎没有受到影响,而低pH值条件下的·OH清除能力较差。Zn~(2+)、Cu~(2+)对牦牛血低聚肽的·OH清除活性影响较大,当二者浓度达到500 mg/L时,其·OH清除活性保持率仅为49.35%、46.15%;K~+、Mg~(2+)对其·OH清除活性影响较小。牦牛血低聚肽对·OH清除活性保持率随冻融次数增多而降低。食品辅料NaCl对其·OH自由基清除活性有增效作用,特别是NaCl添加量为0.5%～1.5%时,而当NaCl添加量为1.5%～2.5%时,增效作用不明显;葡萄糖浓度为8%～10%时,对其·OH清除活性有明显抑制作用;柠檬酸对其·OH清除活性有明显抑制作用,但柠檬酸浓度变化对其·OH清除活性影响不大。牦牛血低聚肽的体外抗氧化活性优于商品化的大豆低聚肽以及鱼胶原低聚肽,将3种食源性低聚肽按比例组合后,在DPPH模型和脂质过氧化抑制能力模型中,大部分组合低聚肽表现出较强的协同作用,组合低聚肽中的牦牛血低聚肽比例超过50%时表现出拮抗作用;在ABTS模型中组合低聚肽中的牦牛血低聚肽比例越高协同作用越低。     

华南地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查与分析

为了解华南地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行、变异及进化情况,从该地区的不同猪场采集2 159份样品,利用RT-PCR方法检测PEDV,扩增了部分PEDV阳性样品中的S、M和ORF3基因并测序,利用生物信息学软件进行序列分析.结果显示,PEDV在猪场中的检出率为100％,在所有样品中的平均检出率为53.0％,在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和母猪样品中,PEDV平均阳性率分别为67.6％、42.8％、12.8％和47.2％.根据S、ORF3和M基因建立的进化树,PEDV可分为2个基因群,其中当前样品株为一群,韩国、美国和中国的参考毒株为一群.结果表明,PEDV在华南地区猪场普遍存在,其基因也在不断发生变化.     

绿色荧光蛋白在微生物与植物互作研究中的应用研究进展

对绿色荧光蛋白的结构、发光机制、荧光检测方法以及在微生物与植物互作研究中的应用进行了详细的阐释,重点对其在根际微生物定殖及其与宿主植物的相互作用、内生菌定殖及其对植物生长促进作用、微生物与植物共生关系、病原微生物与植物的相互作用、微生物中蛋白在宿主植物中的定位、转基因安全与标记等方面的应用进行了综述,并对其应用进行了展望.     

植物与有益微生物互作的分子基础及其应用的研究进展

植物与微生物在长期的侵染和抗侵染过程中逐渐形成了复杂的互作关系,二者相互利用、协同进化。一些病原微生物致病能力的变化或增强迫使植物提高抗病性,同时改进了植物的农艺性状、产量性状和品质性状。植物与微生物互作关系的分子生物学研究促进了植物基因工程育种途径的创立和生产潜力的提高,尤其微生物介导的基因转移已成为改良植物的重要工具。本文概括性综述了植物与一些主要有益微生物互作的应答反应、信号传导和分子基础,以及利用有益微生物对改良植物性状和生产水平的研究进展。描述了植物对主要有益微生物的应答途径,以及植物和农杆菌、根瘤菌、真菌及植物病毒互作的分子信号系统,并介绍了它们在基因工程、遗传育种和生产实践中的应用。对于人们正确认识有益微生物的两面性,改变传统观念,进一步利用有益微生物的正向作用提高植物抗病性、抗逆性、品质和生产潜力,培育优良作物品种等,具有一定参考价值。     

水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的外壳蛋白(coat protein,CP)参与病毒转录、复制等多个生物学过程。病毒蛋白之间的互作对病毒侵染活性非常重要,在明确RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,通过构建CP蛋白N端、M区段和C端(CP-N、CP-M和CP-C)的酵母表达载体,利用酵母双杂交系统确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段。结果表明,N端和C端第1~81个氨基酸是参与水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性区段。这一研究结果不仅有助于加深理解RSV CP蛋白在病毒基因组稳定、复制过程中的作用,也有助于加深了解RSV、寄主和传播介体之间关系。     

土壤有机碳与微生物群落互作关系的研究

主要从土壤微生物在有机碳转化中的作用和土壤活性有机碳对微生物群落的影响两大方面,论述土壤有机碳与微生物群落的互作关系,最后探讨了土壤微生物在协调有机碳分解的生态服务与有机碳长期稳定性之间的作用。     

TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达

运用DNA重组技术将猪传染性胃肠炎病毒核衣壳基因、猪流行性腹泻病毒核衣壳基因编码最大局部亲水性抗原决定簇基因片段进行串联,克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建预防仔猪冠状病毒性腹泻双价基因原核表达质粒.将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,双价重组基因表达...     

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子,在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白,为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础,为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因,将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中,通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中,先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/...