褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌转化生长因子β1的影响及其机制

目的 研究褪黑激素对增生性瘢痕Fb分泌TGF-β1的影响及机制. 方法 采用组织块法分离培养人增生性瘢痕Fb,按随机数字表法将细胞分为褪黑激素组、褪黑激素+Luzindole(褪黑激素受体拮抗剂)组、Luzindole组和对照组(仅以细胞培养液培养),前3组每孔细胞分别添加相应物质与细胞培养液培养,褪黑激素终浓度为1×10-3 mmol/L、Luzindole终浓度为1 mmol/L.每组10个复孔.培养24 h,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1含量,实时荧光定量PCR检测细胞TGF-β1、Smad 7和Rho激酶(ROCK) mRNA表达.对数据进行单因素方差分析或LSD-t检验或Kruskal-Wallis检验,组间比较采用Nemneyi法. 结果 褪黑激素组Fb上清液中TGF-β1含量为(2.8±2.4) pg/mL,低于褪黑激素+Luzindole组的(23.9±2.7)pg/mL、对照组的(28.9±2.0) pg/mL和Luzindole组的(24.9 ±2.8)pg/mL(F=94.58,P＜0.05).褪黑激素组细胞TGF-β1 mRNA表达量为11.9±1.2,明显低于其他组(F=20.79,P＜0.05)；褪黑激素+Luzindole组TGF-β1mRNA表达量(14.9±1.8)与对照组(17.2±0.6)比较差异无统计学意义(t=0.806,P＞0.05).褪黑激素组Fb Smad 7 mRNA表达量(0.076±0.080)明显高于对照组(0.023±0.024)、褪黑激素+Luzindole组(0.026 ±0.026)、Luzindole组(0.037±0.021),x 2=9.567,P＜0.05.褪黑激素组ROCK mRNA的表达量明显低于对照组(0.002 30±0.002 70)、褪黑激素+Luzindole组(0.001 30±0.001 20)和Luzindole组(0.001 10 ±0.001 20),x 2=9.420,P＜0.05. 结论 褪黑激素可通过与受体结合,上调瘢痕Fb中Smad 7表达、下调ROCK表达,从而抑制增生性瘢痕Fb表达TGF-β1.     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

高糖通过转化生长因子β信号诱导肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化

目的 探讨高糖(HG)能否通过转化生长因子β(TGF-β)途径诱导大鼠肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化(EndMT).方法 体外培养大鼠肾小球内皮细胞(GEnC),分为正常对照组(NG,5.5 mmol/L)、高糖组(HG,15、30 mmol/L)、TGF-β抑制剂组(HG+LY36,30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L LY364947)以及高渗对照组(M,5.5 mmol/L葡萄糖+25.5 mmol/L甘露醇)和溶剂对照组(D,5.5 mmol/L葡萄糖+1 ml/LDMSO).采用Western印迹法检测各组细胞内皮细胞标志物claudin5和肌成纤维细胞标志物α-SMA表达变化;实时定量PCR法检测细胞TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达改变;免疫荧光法观察细胞形态学变化以及血管内皮细胞标志物VE-cadherin和肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达.结果 与NG组比较,HG组claudin5蛋白的表达量随葡萄糖浓度增加而降低(P＜0.05),α-SMA蛋白表达量随葡萄糖浓度增加而升高(P＜0.05),TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达均升高(P＜0.05).与HG组比较,TGF-β抑制剂组claudin5蛋白表达量升高(P＜0.05),α-SMA蛋白表达降低(P＜0.05).高渗对照组和溶剂对照组改变差异无统计学意义.激光共聚焦免疫荧光结果显示,高糖处理可引起细胞形态由卵圆形向梭形改变,VE-cadherin表达减少,α-SMA表达增加;TGF-β抑制剂组细胞形态无明显改变.与HG组比较,TGF-β抑制剂组VE-cadherin表达增加,α-SMA表达降低(P＜0.05).结论 高糖诱导大鼠肾小球内皮细胞TGF-β表达增加及内皮细胞-肌成纤维细胞转分化.抑制TGF-β可抑制高糖引起的转分化,提示TGF-β参与了高糖引起的肾小球内皮细胞转分化过程.     

肿瘤相关成纤维细胞培养液上清促进肿瘤细胞增殖和血管生成的研究

目的 探讨在体外实验条件下,肿瘤相关成纤维细胞如何通过旁分泌机制促进肿瘤细胞的增殖和血管生成.方法 分别提取原代卵巢癌相关成纤维细胞(TAFs)与正常卵巢相关成纤维细胞(N Fs)的培养液上清(CM);实验组为2ml TAFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),对照组为2 ml NFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),空白组为正常培养的卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105个/孔),干预组为在实验组中加入20 μmol转化生长因子-β(TGF-β)特异性小分子抑制剂SB-431542(10 μmol/ml);应用流式细胞仪分析各组细胞生长周期;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达,Western blot法检测各组细胞TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白的表达.结果 实验组卵巢癌细胞增殖较对照组显著增加(细胞S期比例:实验组22.10±1.84比对照组12.77±1.43,P＜0.05);而加入SB431542干预后则可明显抑制促增殖作用(细胞S期比例:干预组12.33±1.12比实验组22.10±1.84,P＜0.05);RT-PCR提示实验组PCNA、α-SMA、VEGF mRNA较其他组表达显著上调(P＜0.05),Western blot结果提示实验组TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白表达亦显著上调(P＜0.05),在加入SB-431542后以上基因及蛋白的表达均受到抑制(P＜0.05).结论 卵巢癌相关成纤维细胞可以通过旁分泌机制促进卵巢癌细胞的增殖,并上调血管生成相关基因及蛋白的表达,而通过抑制TGF-β信号通路作用后则可以有效抑制这类作用.     

RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF-[1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA/Rho激酶信号通路的影响,以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞,将第4代细胞用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激后,分不同作用时间(0、3、6、24h)提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度,Western -blot检测α-SMA的表达水平;并用相同的方法检测不同浓度TGF-β1(0、2、10、50 ng/ml)刺激人皮肤成纤维细胞后,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。用RhoA/Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后,再用TGF-β1刺激,作为实验组,将未作处理的正常细胞作为空白对照组,Y-27632（10 μmol/L）组作为阴性对照组,只用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激组作为阳性对照组,分别检测α-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。结果 10 ng/ml TGF-β1按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0h为1.0,3h为1.9+0.2、6h为2.1±0.1,24 h为3.1±0.1。24 h较其他3个时间点α-SMA表达量明显上升（n=4,P＜0.05）。不同浓度TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0 ng/ml为1.0,2 ng/ml为1.4±0.2,10 ng/ml为3.2±0.1,50 ng/ml为3.1±0.2。10 ng/ml表达量明显高于0 ng/ml和2 ng/ml(n =4,P ＜0.05),较50 ng/ml差异无统计学意义(n=4,P＞0.05)。用Y-27632（10 μmol/L）处理后,再用TGF-β1刺激,细胞的表型转化明显受到抑制,实验组α-SMA的表达量(1.2±0.2)较阳性对照组(2.9±0.1)明显降低(n=5,P ＜0.05),与空白对照组(1.0)和阴性对照组(1.1±0.1)相比差异均无统计学意义(n=5,P＞0.05)。结论 RhoA/Rho激酶信号通路参与了 TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1诱导皮肤成纤维细胞作用的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂对转化生长因子(TGF)-β1诱导成纤维细胞(Fb)转分化及对胶原牛成作用的影响.方法 体外培养成人正常皮肤Fb,免疫荧光细胞化学法观察PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)、曲格列酮对TGF-β1诱导的α平滑肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,Western blot检测15d-PGJ2、曲格列酮对TGF-β1诱导的α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响,噻唑蓝(MTT)比色法观察对Fb增殖活性的影响.结果 与TGF-β1诱导组比较,10μmoL/L曲格列酮、10 μmol/L 15d-PGJ2预处理组的α-SMA表达量显著减少(P<0.01),抑制效应分别为31%、57%;预处理组的Ⅰ型胶原表达量也屁著减少(P<0.01),抑制效应分别为57%、38%.曲格列酮、15d-PGJ2对Fb的增殖活性影响分析,各实验组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 PPARγ激动剂能抑制TGF-β1诱导的人正常皮肤Fb的转分化和Ⅰ型胶原合成增多的效应,具有抗瘢痕的潜在作用.     

热损伤角质形成细胞培养上清液对成纤维细胞生物学行为的影响

目的 了解KC热损伤后培养上清液对真皮Fb生物学行为的影响.方法 分离培养人真皮Fb,另建立KC(选用HaCaT细胞)热损伤模型.收集正常堵养及热损伤后12 h的KC培养上清液,用无血清DMEM以1:1体积比稀释,分别制成正常KC和热损伤KC 2种条件培养液.将Fb分别用无血清DMEM和2种条件培养液培养:(1)于培养12、24、36、48 h时,采用噻唑蓝法检测Fb增殖活性;(2)于培养12 h时,用流式细胞术检测Fb的凋亡情况(Fb预先致热损伤,并增设Fb伤后无处理对照);(3)培养24 h时,用免疫荧光法检测Fb胞质α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,并用实时定量PCR法测定Fb α-SMA mRNA的表达.对实验结果进行单因素方差分析,用LSD-t检验行组间两两比较.结果 (1)Fb增殖活性:Fb经热损伤KC条件培养液培养12、24、36、48 h时,其吸光度值均高于同时相点用无血清DMEM培养的Fb(t值分别为1.89、2.35、2.02、1.94,P值均小于0.01);其中12、24、48 h时与用正常KC条件培养液培养的Fb比较,差异有统计学意义(12 h时t=1.83,P<0.01;24 h时t=2.91,P<0.05;48 h时t=1.83,P<0.05).(2)Fb凋亡检测:热损伤KC条件培养液培养的Fb与正常KC条件培养液培养以及伤后无处理的Fb比较,凋亡率均明显下降(t=3.31,P<0.05;t=1.47,P<0.01).(3)Fb胞质α-SMA表达:荧光显微镜下可见,用无血清DMEM或正常KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达(红色荧光)细胞较少;热损伤KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达细胞明显增多.(4)α-SMA mRNA表达:热损伤KC条件培养液培养的Fb α-SMA mRNA相对表达量为1.32±0.06,高于正常KC条件培养液培养的Fb(1.14±0.07,t=2.51,P<0.05)和无血清DMEM培养的Fb(1.00±0.09,t=1.77,P<0.05).结论 KC热损伤后12 h培养上清液可明显促进Fb增殖、抑制Fb凋亡、促进Fb向肌成纤维细胞转分化.     

HGF拮抗TGF-β1诱导腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质合成

目的 研究HGF能否阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质过度合成.方法 选取成年新西兰大白兔7只,体重3.75～4.00 kg,无菌切取前肢中趾趾深屈肌腱,进行腱鞘成纤维细胞的分离和培养,待细胞生长成单层后,以胰蛋白酶消化传代.取第3代成纤维细胞用于实验,当细胞达到70%融合时,培养液中加入TGF-β1(5 ng/ml)及HGF(10～40 ng/ml).培养72 h后,利用Westernblot检测α-SMA表达;ELISA测定细胞Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达.结果 TGF-β1能显著诱导α-SMA表达,半定量分析提示,TGF-β1作用后的成纤维细胞α-SMA表达量是对照组的1.8倍.随HGF的同时加入,α-SMA的表达则明显受抑制(P＜0.05),且随HGF浓度的升高其阻抑作用呈逐渐增强趋势.TGF-β1同样能诱导Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达(P＜0.01),而HGF则可以有效地阻抑其表达,其效应呈剂量依赖性(P＜0.05).结论 HGF可以有效阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA、Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达,这为利用HGF预防和治疗屈指肌腱损伤后粘连及瘢痕在细胞和分子水平提供了依据.     

重组人核心蛋白多糖固相拮抗转化生长因子β1对瘢痕成纤维细胞的刺激作用

目的模拟人体内核心蛋白多糖和转化生长因子β1(TGF-β1)接触方式,观察核心蛋白多糖固相拮抗TGF-β1刺激瘢痕成纤维细胞的效果.方法制备成纤维细胞胶原网格(FPCL)体外三维培养模型,将其分为4组.对照组向FPCL中加入培养液;核心蛋白多糖组向FPCL中混入终浓度2 mg/L的重组人核心蛋白多糖,再加入培养液;TGF-β1组向FPCL中加入含5 μg/L TGF-β1的培养液;TGF-β1+核心蛋白多糖组向FPCL中混入终浓度2 mg/L的重组人核心蛋白多糖,然后加入含5μg/L TGF-β1的培养液.在培养12、24、48、72、96 h时观察各组FPCL的收缩情况,并用蛋白质印迹法与逆转录聚合酶链反应分别检测FPCL中瘢痕成纤维细胞Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白及mRNA表达水平.结果各培养时相点下,TGF-β1组FPCL收缩比对照组明显增强,核心蛋白多糖组FPCL收缩则比对照组明显减弱.TGF-β1组的PAI-1、α-SMA的蛋白及相应mRNA表达水平(3 482±211、4 320±272;0.89±0.15、0.56±0.11)显著高于对照组(1 764±147、1 699±146;0.29±0.06、0.21±0.06,P＜0.01);其余两组相应检测指标与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论重组人核心蛋白多糖混入胶原凝胶,可显著抑制TGF-β1对瘢痕成纤维细胞的刺激作用,表明在体外核心蛋白多糖具有拮抗TGF-β1的作用.提示皮肤组织损伤后,由于创面机械性缺少核心蛋白多糖,TGF-β1活性上调,可能是瘢痕增生的一个重要因素.     

油酸对人正常和瘢痕成纤维细胞增殖和分泌炎症介质的影响

目的 探讨油酸对人正常Fb和瘢痕Fb增殖和分泌炎症介质的影响. 方法 体外培养人正常Fb和瘢痕Fb,分别按照随机数字表法分为7组(各组样本数为8):空白对照组,除常规成分外培养液中不再添加其他物质;乙醇对照组,培养液中加入终浓度为体积分数2％无水乙醇;不同浓度油酸组,即0.25、0.50、1.00、2.00以及4.00 mmol/L油酸组,培养液中分别加入相应终浓度的油酸(以含体积分数2％无水乙醇培养液配制).采用锥虫蓝染色法观察各组细胞培养1～5d的生长情况.于倒置相差显微镜和透射电镜下观察2种细胞2个对照组、1.00 mmol/L油酸组细胞培养2d的细胞结构,采用流式细胞仪检测2种细胞2个对照组及1.00 mmol/L油酸组细胞培养2d的细胞周期.噻唑蓝法检测各组细胞培养2d的增殖情况.取各组细胞培养2d时的培养上清液,采用改良Griess法测定NO含量,ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8含量.对数据进行多因素方差分析及重复测量设计的方差分析. 结果 (1)正常Fb和瘢痕Fb的空白对照组与乙醇对照组比较,各指标均无明显差别.(2)培养2～5d,正常Fb和瘢痕Fb 2.00、4.00 mmol/L油酸组细胞数量均低于对应的2个对照组(F值分别为13.773、11.344,P值均小于0.01).(3)培养2d,正常Fb和瘢痕Fb1.00 mmol/L油酸组细胞数量明显减少,部分细胞开始堆积、变圆易脱落;细胞膜不完整,线粒体空泡变性,核固缩,胞内可见脂滴.(4)正常Fb 1.00 mmol/L油酸组的G0/G1期和G2/M期细胞百分比[(93.56±9.98)％、(2.01士0.75)％]显著高于空白对照组[(84.23±10.96)％、(0.37±0.16)％],F值分别为3.026、34.751,P＜0.05或P＜0.01;S期细胞百分比为(4.42 ±0.87)％,明显低于空白对照组的(16.06±1.74)％,F=136.120,P＜0.01.瘢痕Fb 1.00 mmol/L油酸组G0/G1期和G2/M期细胞百分比分别为(93.86±13.90)％、(1.89±0.66)％,显著高于空白对照组[(83.88±10.42)％、(0.41±0.17)％],F值分别为3.529、32.710,P＜0.05或P＜0.01;S期细胞百分比为(3.87±0.63)％,明显低于空白对照组的(15.89±2.02)％,F=116.508,P＜0.01.(5)正常Fb和瘢痕Fb 0.50 ～4.00 mmol/L油酸组细胞增殖率显著低于对应的2个对照组(F值分别为215.945、194.555,P＜0.05或P＜0.01).(6)正常Fb各浓度油酸组细胞分泌NO水平明显高于2个对照组(F=30.240,P＜0.05或P＜0.01);瘢痕Fb 1.00～ 4.00 mmol/L油酸组细胞分泌NO水平明显高于2个对照组(F=12.495,P＜0.01).正常Fb和瘢痕Fb 2.00、4.00 mmol/L油酸组细胞分泌TNF-α、IL-6水平明显高于对应的2个对照组(F TNF-α值分别为6.911、3.818,FIL-6值分别为16.939、11.600,P ＜0.05或P＜0.01).正常Fb和瘢痕Fb各浓度油酸组细胞分泌IL-1β水平显著高于对应的2个对照组(F值分别为25.117、9.137,P值均小于0.01).正常Fb 1.00～4.00 mmol/L油酸组细胞分泌IL-8水平明显高于2个对照组(F=2.717,P＜0.05或P＜0.01),瘢痕Fb 2.00、4.00 mmol/L油酸组细胞分泌的IL-8水平明显高于2个对照组(F=3.338,P＜0.05).正常Fb和瘢痕Fb相同浓度油酸组各炎症因子水平比较无明显差异(F值为0.120 ～3.766,P值均大于0.05). 结论 高浓度油酸虽能抑制瘢痕Fb增殖,但同时也抑制正常Fb增殖,且高浓度油酸能同时促进正常Fb和瘢痕Fb分泌炎症介质,从而导致过度、持续的炎症反应,不利于创面愈合.     

γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用

目的 了解γ干扰素(IFN-γ)对瘢痕疙瘩Fh(KFb)中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN一γ治疗病理性搬痕的可能机制. 方法 切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞.(1)将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β_1组,用10 ng/mL的TGF-β_1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β_1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β_1与100 nS/mL的IFN-γ联合作用.采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达与阳性细胞表达情况.(2)另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达.(3)另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ns/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组.同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达. 结果 (1)IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组(0.024±0.013与1.229±0.011)显著减少(P<0.05);TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β_1组(1.331±0.298与1.727±0.004)显著减少(P<0.01).IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度(0.922±0.059)和α-SMA蛋白表达量(0.3051±0.0031)较对照组(1.055±0.005与0.4513±0.0094)显著减少(P<0.01);TGF-β1+IFN-γ组SMA阳性KFb荧光强度(1.129±0.004)和SMA蛋白表达量(0.6734±0.0098)较TGF-β_1组(1.270±0.005与1.38420.0024)显著减少(P<0.01).(2)10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至最低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前(P<0.01);其蛋白表达量于作用后2~8 h显著低于作用前(P<0.01).而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前(P<0.05).(3)与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05或P<0.01),Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01),且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著. 结论 IFN-γ呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β_1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad 信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.     

α—平滑肌肌动蛋白在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的诱导作用。方法 以5例增生性瘢痕为实验组,3例正常瘢痕为对照组,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察在不同TGF-β1浓度作用下,来源于实验组和对照组的成纤维细胞表达α-SMA的情况。结果 实验组的成纤维细胞,三维培养体系中α-SMA含量明显低于二维培养体系,不同浓度TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ng/ml的TGF-β1作用最有效;与对照组的成纤维细胞相比,实验组的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感。结论 在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;实验组与对照组中的成纤维细胞在细胞性状方面存在差异,对TGF-β1敏感性不同;细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少。     

丹参抑制转化生长因子-β1诱导的肌源性干细胞向肌成纤维母细胞分化

目的 观察丹参对失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向肌成纤维母细胞分化的抑制作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,加入转化生长因子-β1(TGF-β1)和丹参进行干预,将细胞分为3组:A:对照组;B:10 μg/L TGF-β1组;C:10 μg/L TGF-β1+ 150 mg/L丹参组.荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞在干预后5个时间点α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin) mRNA和蛋白表达.结果 与A组比较,B组和C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA在干预后第2、3、5、7天均明显升高(P＜0.05),其蛋白表达在干预后第3、4、6、8天亦显著升高(P＜0.05);与B组比较,C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA和蛋白在对应时间点均明显降低(P＜0.05).结论 丹参能抑制TGF-β1诱导的失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞的分化.     

乳酸-转化生长因子-β1途径促进肺成纤维细胞活化介导机械通气相关性肺纤维化的机制研究

目的探讨机械通气促进肺成纤维细胞活化及肺纤维化的机制,明确乳酸-转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)途径在该过程中的作用。方法①将C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为假手术组(Sham组)和机械通气组(MV组),每组12只,其中Sham组仅行麻醉插管处理并保持自主呼吸,MV组采用20 ml/kg潮气量和70次/min通气频率行单次2 h机械通气,观察7 d后取材。采用H-E染色、Masson染色观察肺组织的损伤程度和纤维化程度,采用Western blot法检测肺组织Ⅰ型胶原蛋白α1链(collagen typeⅠalpha 1 chain,COL1A1)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和TGF-β1的蛋白表达情况,采用比色法检测小鼠肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF)和血清的乳酸浓度。②将人胚肺成纤维细胞MRC-5采用随机数字表法分为4组(每组3个孔):PBS对照组(Con组)、1 mmol/L乳酸组(Lac1组)、10 mmol/L乳酸组(Lac_(10)组)和20 mmol/L乳酸组(Lac_(20)组),于乳酸刺激MRC-5细胞24 h后采用ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1含量,同时采用细胞免疫荧光观察α-SMA的表达情况;于乳酸刺激MRC-5细胞72 h后采用Western blot法检测不同分组细胞COL1A1和α-SMA的表达情况,并通过ELISA法检测细胞培养上清液Ⅰ型前胶原羧基肽(procollagen type I carboxyl peptide,PICP)的含量变化。③另取MRC-5细胞采用随机数字表法分为3组(每组3个孔):PBS对照组(Con组)、20 mmol/L乳酸组(Lac_(20)组)和20 mmol/L乳酸+TGF-β1受体抑制剂(SB431542)组(Lac_(20)+SB组),处理24 h后采用Western blot法检测不同分组细胞COL1A1和α-SMA的表达情况。结果①与Sham组比较,MV组小鼠肺泡间隔增厚、胶原蛋白沉积、肺纤维化程度加重,伴有COL1A1、α-SMA和TGF-β1表达水平升高(P<0.05),血清和BALF乳酸浓度升高(P<0.05)。②与Con组比较,Lac_(10)组和Lac_(20)组细胞培养上清液中TGF-β1、PICP含量升高(P<0.05),细胞中COL1A1和α-SMA表达水平升高(P<0.05),免疫荧光观察到α-SMA在细胞内表达增多(P>0.05)。③与Lac_(20)组比较,Lac_(20)+SB组细胞COL1A1和α-SMA表达水平降低(P<0.05)。结论机械通气可以通过乳酸-TGF-β1途径活化肺成纤维细胞,引起胶原蛋白分泌,促进机械通气相关性肺纤维化进程。     

冬虫夏草菌粉对5/6肾大部切除大鼠肾脏纤维化的抑制作用及机制

目的 探讨冬虫夏草菌粉对5/6肾大部切除术大鼠肾脏纤维化的抑制作用及其可能机制.方法 30只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham组,n=10)、5/6肾大部切除模型组(SNx组,n=10)以及5/6肾大部切除+冬虫夏草菌粉干预组(CS组,n=10).术前及术后4、8、12周分别检测大鼠体质量、尿蛋白量变化,并于术后第12周末处死大鼠,检测血尿素氮、肌酐变化,取肾组织切片行HE、Masson染色观察肾脏病理变化,免疫组化观察转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβR Ⅰ)、Ⅱ型受体(TβR Ⅱ)的表达,免疫荧光观察E-c adherin、α-SMA的表达,Western印迹法检测肾脏组织TGF-β1、TβR Ⅰ、TβR Ⅱ、磷酸化(p)Smad2/3、Smad7、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 术后CS组大鼠的体质量高于SNx组,尿蛋白量及血尿素氮、血肌酐低于SNx组.肾脏组织病理分析显示,CS组肾小球硬化、肾小管间质损伤程度均显著低于SNx组(均P＜0.01).CS组TGF-β1、TβR Ⅰ、TβR Ⅱ、p-Smad2/3蛋白表达量均显著低于SNx组(均P＜0.05),E-cadherin蛋白表达量显著高于SNx组(P＜0.05),α-SMA蛋白表达量显著低于SNx组(P＜0.05),Smad7蛋白表达量显著高于SNx组(P＜0.05).结论 冬虫夏草菌粉对5/6肾大部切除大鼠肾脏纤维化具有明显的抑制作用,其机制可能是与其抑制TGF-β1及其下游信号通路以及抑制EMT的发生有关.     

人瘢痕疙瘩成纤维细胞相关基因表达及青蒿琥酯的作用

目的 验证瘢痕疙瘩Fb中是否存在钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)和分化抑制因子1(ID1)的异常表达,观察青蒿琥酯对二者的影响. 方法 收集笔者单位患者手术后废弃的瘢痕疙瘩样本15个和正常皮肤组织样本12个,采用组织微粒贴壁法行Fb原代培养,取第3～8代细胞用于实验.免疫荧光染色观察2种Fb中CASK和ID1的表达,瘢痕疙瘩Fb用不同浓度青蒿琥酯作用不同时间,通过噻唑蓝比色法确定药物的半数抑制浓度(IC50)并作为后续实验药物干预浓度.选取正常皮肤Fb设为正常对照组(添加培养液处理),收集瘢痕疙瘩Fb分为瘢痕对照组(添加培养液处理)及瘢痕给药组(添加含IC50青蒿琥酯的培养液处理),流式细胞术检测各组Fb细胞周期和凋亡的变化,RT-PCR、蛋白质印迹法检测各组Fb中CASK和ID1的基因与蛋白表达情况.对数据行单因素方差分析及LSD-t检验. 结果 瘢痕疙瘩和正常皮肤Fb中均存在CASK和ID1表达,选择75 mg/L青蒿琥酯为后续实验干预浓度.(1)G0/G1期和G2/M期的细胞百分比3组之间比较,差异有统计学意义(F值分别为118.064、163.840,P值均小于0.01).其中瘢痕给药组G0/G1期为(91.4±1.4)％,明显高于瘢痕对照组的(80.7±0.3)％和正常对照组的(82.4±0.6)％(t值分别为12.740、9.872,P值均小于0.05);G2/M期为(6.9±0.3)％,明显低于瘢痕对照组的(13.7±0.3)％和正常对照组的(12.7±0.8)％(t值分别为43.702、12.276,P值均小于0.05).(2)早晚期细胞凋亡率3组之间比较,差异均有统计学意义(F值分别为61.879、4710.862,P值均小于0.01).其中瘢痕给药组早期凋亡率为(7.1±1.0)％,明显高于瘢痕对照组的(2.6±0.4)％和正常对照组的(2.7±0.3)％(t值分别为7.974、7.767,P值均小于0.05);晚期凋亡率为(14.9±0.3)％,明显高于瘢痕对照组的(2.3±0.3)％和正常对照组的(2.5±0.4)％(t值分别为72.882、69.792,P值均小于0.05).(3)瘢痕对照组CASK基因表达量为0.658±0.024,低于正常对照组的1.076±0.008(t =28.997,P＜0.01);瘢痕给药组的基因表达量为0.855±0.008,较瘢痕对照组上升(t=13.549,P＜0.01).瘢痕对照组CASK蛋白表达量为0.067±0.007,低于正常对照组的0.179±0.015(t=12.042,P＜0.01);瘢痕给药组为0.132±0.010,较瘢痕对照组上升(t=9.498,P＜0.01).(4)瘢痕对照组ID1基因表达量为0.416±0.006,高于正常对照组的0.317±0.020(t=8.299,P＜0.01);瘢痕给药组为0.217±0.009,较瘢痕对照组下降(t=32.417,P＜0.01).瘢痕对照组ID1蛋白的表达量为0.789±0.034,高于正常对照组的0.366±0.029(t=16.341,P＜0.01);瘢痕给药组为0.114±0.006,较瘢痕对照组下降(t=33.978,P＜0.01). 结论 推测CASK和ID1参与了瘢痕疙瘩Fb的增殖过程,青蒿琥酯抑制瘢痕疙瘩Fb增殖的机制可能与上调CASK和下调ID1表达有关.     

TGF-β1对病理性瘢痕成纤维细胞中β-catenin表达的影响及意义

目的 探讨TGF-β/Smad信号转导通路与Wnt/β-catenin信号转导通路在病理性瘢痕发病机制中的作用及相互关系.方法 随机选取瘢痕疙瘩(K组)、增生性瘢痕(H组)和正常皮肤组织(N组)各3例,进行原代成纤维细胞培养,用不同浓度的TGF-β1处理细胞,应用免疫组化技术检测β-catenin在各组中的表达变化.结果 β-catenin在各组中的表达水平随TGF-β1浓度变化,呈先递增后递减趋势,三者β-catenin表达变化幅度为K组＜H组＜N组,K组成纤维细胞与H组成纤维细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05),而N组成纤维细胞与K组、H组成纤维细胞相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TGF-β/Smad信号转导通路与Wnt/β-catenin信号转导通路联合作用,导致病理性瘢痕形成.     

LeftyA真核表达载体的构建及其对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)的影响.方法 基因克隆技术构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,将其瞬时转染HK-2细胞,TGF-β1(10μg/L)刺激后,观察细胞形态变化,检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及蛋白的表达.结果 TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,α-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于α-SMA;LeftyA蛋白可以显著抑制E-cadherin蛋白的下调表达(P＜0.05),其表达比同时间点单纯刺激组高17.6%;同时可逆转α-SMA蛋白的上调表达(P＜0.05),其蛋白表达比单纯刺激组低14.0%.结论 LeftyA蛋白可以抑制TGF-β1所致的EMT.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector for LeftyA and study the effects of LeftyA on epithelial to mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 ( TGF-β1 ). Methods The pcDNA3. 1-LeftyA was constructed by recombinant DNA technique. After transfection with pcDNA3. 1-LeftyA HK-2 cells were stimulated by TGF-β1( 10 μg/L). The morphological changes, and the expression of E-cadherin, α-SMA and LeftyA mRNA and protein were observed and detected, respectively. Results TGF-β1 could markedly decrease the expression of E-cadherin mRNA and protein in HK-2 cells induced, and dramatically increase the expression of α-SMA mRNA and protein in a time-dependent manner. Forced expression of exogenous LeftyA led to a blockage of TGF-β1 -induced E-cadherin ( 17.6% ) suppression and α-SMA induction ( 14. 0% ). Conclusion Disruption of cell adherence is the beginning stage of EMT, and overexpression of LeftyA can suppress EMT induced by TGF-β1, which suggests a alprostadil role for LeftyA in TGF-β1-induced tubular EMT and renal fibrosis.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂拮抗人皮肤成纤维细胞转化生长因子β1机制研究

目的 了解过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂拈抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的效应机制.方法 体外培养正常成人皮肤Fb,根据培养基中所加刺激物不同分为空白对照组(无血清DMEM培养基),TGF-β1组(DMEM培养基加入含终浓度10 ng/mL TGF-β1作用48 h),曲格列酮组(DMEM培养基加入含终浓度10μmol/L曲格列酮作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48h),15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)组(DMEM培养基加入含终浓度10 μmol/L 15d-PGJ2作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48 h).应用蛋白质印迹法检测结缔组织生长因子(CTGF)的表达,实时荧光RT-PCR检测CTGF、基质金属蛋白酶1(MMP-1)及血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平变化.对数据进行单因素方差分析.结果 TGF-β1组的CTGF蛋白和mRNA表达水平均高于空白对照组,曲格列酮组和15d-PGJ2组的CTGF蛋白及mRNA表达水平低于TGF-β1组.空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ 2组MMP-1 mRNA表达水平分别为1.281±0.195、0.193±0.051、0.417±0.043、0.485±0.027,其中TGF-β1组低于空白对照组(F=12.811,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组高于TGF-β1组(F=12.811,P值均小于0.01).空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ2组PDGF mRNA表达水平分别为0.349±0.057、1.044±0.237、0.677±0.055、0.511±0.017,其中TGF-β1组高于空白对照组(F=16.848,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组低于TGF-β1组(F=16.848,P值均小于0.01).结论 激活后的PPARγ对TGF-β1下游反应因子CTGF的抑制作用,可能是其拮抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的主要机制,而对细胞因子MMP-1、PDGF的影响可能也是其机制之一.     

α-平滑肌肌动蛋白及转化生长因子-β1基因在小鼠异位移植气管中的表达

目的 探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子-β1(TGF-β1)在小鼠异位移植气管中的表达与意义.方法 雄性BALB/C小鼠及C57BL/6小鼠各30只,建立气管异位移植模型,分别于术后4、7、10 d、2、3、4周收获移植气管.组织形态学观察移植气管发生纤维化过程,应用免疫组织化学方法检测α-SMA和TGF-β1的表达.结果 术后3周以后移植气管管腔和黏膜下层出现大量纤维增生组织,造成管腔完全闭塞.α-SMA表达于术后第7天明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),1周以后阳性表达继续增多,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).TGF-β1的表达于术后第10天明显增多,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),到术后2周表达水平进一步增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),两者表达的趋势相似.结论 小鼠气管异位移植后气道上皮细胞有部分向表达α-SMA的肌纤维母细胞转化,进而参与了闭塞性细支气管炎(OB)的气道重塑和气道高反应性的发生发展.