采用活体成像技术观察肿瘤组织在裸鼠体内生长情况的研究

目的 采用活体成像技术监测稳定高表达荧光素酶报告基因的肿瘤细胞在裸鼠体内生长及转移情况,为肿瘤治疗药物的研发提供新的评价技术和方法.方法 采用Lipofectamine 2000介导的基因转染方法,将pGL4.17[luc2/neo]载体转染人肝癌细胞株HepG2,经G418抗性筛选及有限稀释法获得稳定高表达荧光素酶的单克隆细胞;采用活体成像的方法检测转染细胞在裸鼠体内的成瘤情况.结果 获得了可稳定高表达荧光素酶基因的单克隆细胞株,将单克隆细胞株植入裸鼠皮下.采用活体成像技术准确监测肿瘤细胞体内生长情况.结论 采用活体成像技术构建的肿瘤动物模型是拓展肿瘤体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型.     

猪囊虫DNA疫苗在猪体内的组织分布及其安全性探讨

研究猪囊虫DNA疫苗pVAX-S-△c-3n在仔猪体内的组织分布情况，并对其安全性进行分析。将猪囊虫DNA疫苗以肌注方式免疫仔猪，分别于接种后1d，7d，4w，8w，12w分离各组织，提取组织总DNA，用PCR法扩增质粒上抗原基因的部分序列，分析质粒DNA在不同组织内的分布及随时间变化的情况。结果表明接种后第一天，除了脑，其余组织都能检测到质粒，但随时间延长，仅注射部位能检测到质粒，且数量不断下降。肌注质粒在猪体内注射部位以外的组织中较短时间就被清除，因此质粒与染色体发生整合的可能性不大。     

DNA疫苗的研究现状

DNA疫苗的概念提出已有十几年的时间，其间针对DNA疫苗的研究工作取得了很大进展，其有效性已在动物体内得到了验证，而且部分疫苗已进入临床试验阶段，但在取得进展的同时也遇到了许多制约其发展的难题。本文对DNA疫苗发展现状，遇到的问题，采取的策略及可能引起的副反应加以综述。     

靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的不对称siRNA的稳定性和体内分布研究

目的:探讨靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的不对称siRNA (asiRNA)在血清和动物体内的稳定性和在动物体内分布情况.方法:用内皮抑素同脂质胶束联合递送asiRNA,琼脂糖凝胶电泳法检测asiRNA的血清稳定性,ELISA法和活体荧光成像法检测asiRNA的体内分布.结果:改变合适的实验条件和asiRNA的修饰,可提高asiRNA的血清稳定性.用ELISA法检测出静脉给药15 min后双链asiRNA在血液、肝、肺和肾内浓度较高,用活体荧光成像法检测出静脉给药24h后asiRNA向肾内汇集排泄,两种检测方法测得asiRNA在脾内浓度较低.结论:两种检测方法方便实用,灵敏度不同,均可用于阳离子脂质体递送asiRNA的体内分布检测.     

小动物体内可见光成像技术及其在药物研发领域的应用

小动物体内可见光成像是对小动物体内的细胞运动，基因表达及蛋白行为等生物学现象进行直接观察的一种新方法。利用一套非常灵敏的光学成像系统，我们可以观察荧光素酶基因或者荧光蛋白以及其他荧光染料标记的细胞，基因，蛋白或其他大分子在活体动物体内的表达，生长，运动和相互作用。因为其极高的灵敏度，安全性及使用方便等特点，小动物体内可见光成像技术在基础医学和药物研发等领域得到了广泛应用。短短几年内，利用这个技术已经发表了六百多篇文章，在Nature和Science上就发表了近五十篇文献。最近的一篇文献中，利用这个技术，研究人员在小动物体内观察到了荧光素酶基因标记的一个细胞，展现了这个技术在动物体内生物学现象研究领域的极大潜力。基于基础医学研究的成功，这个技术也广泛的应用于药物研发领域，尤其是抗肿瘤药物的早期疗效和抗生素的研发等领域。仅在最近几年，就有十一个肿瘤药物和抗生素的研发在上报给美国FDA的实验数据中采用了小动物体内成像技术。这个技术主要应用于药物研发的以下几个方面：     

NMM抗肿瘤DNA疫苗原液大肠杆菌菌体蛋白质残留量检测方法的建立与验证

目的 建立并验证检测NMM抗肿瘤DNA疫苗原液中大肠杆菌菌体蛋白质残留量的双抗体夹心ELISA试验方法。方法 使用双抗体夹心ELISA试验方法检测NMM抗肿瘤DNA疫苗原液中大肠杆菌菌体蛋白残留量,采用四参数logstic曲线进行回归分析,并对该方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等进行验证,验证通过对5批样品进行检测。结果 采用双抗体夹心ELISA试验方法进行大肠杆菌蛋白质残留量检测时,DNA疫苗原液无需进行稀释。NMM抗肿瘤DNA疫苗原液对大肠杆菌菌体蛋白质的检测无干扰及抑制作用,方法的专属性良好;本法检测限为0.41 ng/ml;定量限为0.98 ng/ml;该方法测定宿主菌蛋白质残留量在0～100 ng/ml范围内线性良好,R2≥0.9999;本方法重复性试验中宿主菌蛋白质含量RSD值均低于15%,中间精密度实验中样品吸光值RSD值低于10%,精密度结果良好。在检测线性范围内加入高、中、低3种浓度的大肠杆菌菌体蛋白,回收率均值为100.35%(n=9,RSD=3.58%);本方法检测实验条件发生微小变动时（不同人员、不同批次试剂盒）,对测定结果的影响...     

新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究

目的 研究建立新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制标准和评价体系,为EV71疫苗研发提供基础.方法 根据创新型疫苗研发的要求,充分发挥技术优势,开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究.结果与结论 建立EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品,统一不同企业疫苗的质控标准,规范疫苗的评价体系,为EV71疫苗的研发提供保障.     

NMM抗肿瘤治疗性DNA疫苗中卡那霉素残留量检测方法的建立与验证

建立并验证检测NMM抗肿瘤DNA疫苗中卡那霉素残留量的方法。采用间接竞争ELISA方法检测卡那霉素残留量,采用四参数Logstic曲线进行回归分析,并对本方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等进行验证,验证方法有效后对多批次样品进行检测。使用该方法检测卡那霉素残留量时,样品无需稀释,辅料、质粒DNA对卡那霉素的检测无干扰;本方法检测限为0.15 ng/mL;定量限为0.5 ng/mL;在0.5～40.5 ng/mL范围内线性关系良好,且符合四参数方程式：y=D+(A-D)/[1+(x/C)^B],R²≥0.999;在检测线性范围内加入不同浓度的卡那霉素对照溶液,回收率均值在95%～115%之间(n=12,RSD=6.20%);本方法重复性试验中卡那霉素含量RSD值为4.22%(n=6),中间精密度试验中DNA疫苗中卡那霉素含量RSD值为10.95%。本方法检测实验条件发生微小变动时(不同人员、不同批次试剂盒、不同酶标仪),对测定结果的影响在可接受范围内。应用该方法对7批样品中卡那霉素残留量进行检测,结果表明,每个人用...     

检测百日咳抗原的系列酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在百日咳疫苗生产中的应用

 目的   评估检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)和黏着素(pertactin,Prn)的3种酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine,aPV）生产质量控制中的应用。 方法   对3种酶免疫测定试剂盒进行热加速试验（37 ℃放置3 d）和长期稳定性试验（4 ℃放置6月）,根据试剂盒的标准曲线相关系数、最高浓度标准品与阴性对照的吸光度值之比（P/N）值、质控品回收率评估试剂盒的稳定性。将3种试剂盒用于aPV生产的发酵、纯化、吸附阶段的PT、FHA、Prn定量检测,以确定3种试剂盒对aPV生产质量控制的可行性。 结果   3种酶免疫测定试剂盒的37 ℃热加速试验和4 ℃长期稳定性试验的各项质量参数均符合相关要求。采用试剂盒定量各生产阶段的百日咳抗原含量显示：百日咳杆菌的发酵终点在第42~46 h;各3批PT、FHA和Prn组分液的纯化回收率分别为49.24%、56.12%和63.65%、68.75%、55.60%和49.76%、75.73%、60.63%和50.10%。采用单独吸附的铝佐剂抗原吸附率高于采用混合吸附,但单独和混合吸附方式制备的疫苗的效力无差异。 结论   检测PT、FHA和Prn的3种酶免疫测定试剂盒具有良好的稳定性,可用于aPV生产的质量控制。     

蟾蜍灵在体内外抑制急性红白血病细胞K562增殖及下调WT1表达的研究

目的研究蟾蜍灵在体内外抗K562细胞增殖及对WT1表达影响。方法半固体集落形成实验检测蟾蜍灵对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术分析蟾蜍灵对K562细胞周期的影响,Western blot观察蟾蜍灵对WT1表达作用。通过高致瘤性K562细胞制备裸鼠皮下荷瘤模型,分组为模型组、蟾蜍灵组及高三尖杉酯碱组,比较各组皮下瘤体积与重量、病理形态学改变及WT1蛋白表达情况。结果①半固体集落形成实验、流式及Westem blot结果显示,蟾蜍灵能明显抑制K562细胞增殖,阻滞细胞在G_0/G_1期,并下调其WT1蛋白表达,呈剂量依赖性;②蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠肿瘤的抑瘤率均明显高于模型组(P<0.05),且蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠皮下瘤重量均明显低于模型组(P<0.05);③病理切片显示,蟾蜍灵导致K562皮下瘤组织内肿瘤细胞大量坏死、凋亡,继发出血及纤维化等改变;并明显抑制K562皮下瘤组织中WT1蛋白表达水平。结论蟾蜍灵在体外可抑制K562细胞增殖及阻滞细胞周期于G_0/G_1期并下调其WT1蛋白表达,在体内可明显抑制裸鼠K562皮下瘤体积和重量,导致皮下瘤组织坏死、凋亡,并可下调其WT1蛋白的表达。     

复杂抗生素多黏菌素E甲磺酸钠的组分与杂质谱研究及在质量控制中的应用

目的:建立二维液质联用方法确定多黏菌素E甲磺酸钠(CMS)杂质的结构及来源,进而用于药物质量控制研究。方法:一维系统：采用Acquity UPLC^?Peptide CSH C₁₈(150 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲液(7.8 g·L^-1磷酸二氢钠,用1 mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH至6.4)-乙腈(19∶1)为流动相A,磷酸盐缓冲液-乙腈(1∶1)为流动相B,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,柱温30℃;二维系统：采用Acquity BEH C₁₈柱(50 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱,以甲酸铵(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱,流速0.2 mL·min^-1,柱温40℃,检测波长210 nm。质谱检测器采用ESI源,负离子扫描模式。结果:采用2D-LC-Q TOF MS法,推定了CMS中55个杂质的结构,并推测其主要来源为多黏菌素E1-I、多黏菌素E1-7MOA、多黏菌素E3及多黏...