非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的　测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法　采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体结合反应曲线 ,计算出抗HBsAgFab及抗HBsAgIgG的亲和常数。结果　人源基因工程抗体抗HBsAgFab的功能性亲和常数在 10 7～10 8M 1水平 ,比完整抗HBsAgIgG仅仅小约 1个数量级 (10 8～ 10 9M 1)。结论　该基因工程抗体与抗原结合能力较强 ,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础。     

人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究

目的：探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法，以期大量获取人源抗HBsAg Fab。方法：在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律，筛选最佳的培养模式及诱导表达条件，后于发酵罐中行补料高密度发酵试验，以确定最佳补料模式。结果：由摇瓶发酵获得的数据表明，当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点，在250℃下以O．2％arabinose诱导12h条件下Fab的产率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大OD600达到55．2，相当于湿菌含量110g/L水平。同时，经证实Fab的抗原结合活性良好。结论：确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。     

重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化方法比较研究

目的研究重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化条件。方法采用羊抗人Fab抗体亲和层析柱、14F7单克隆抗体亲和层析柱、离子交换-分子筛层析柱,分别纯化由酵母工程菌(Gs115／Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并对3种纯化方法所得Fab抗体的纯度、收率、与HBsAg的结合活性进行比较。结果3种纯化方法中,14W单克隆抗体柱纯化的Fab抗体的纯度达98％左右,Fab抗体柱纯化的Fab抗体的纯度为95％,但这两种亲和柱的目的蛋白收率都不高,分别为35％、55％。而离子交换柱纯化的Fab抗体的纯度为93．8％,经分子筛柱进一步纯化后,可达98％以上,Fab抗体蛋白收率可达80％以上。经ELISA分析,3种方法纯化的Fab抗体均具有较高的HBsAg抗原结合力和特异性。结论通过对3种纯化方法的比较得出,离子交换一分子筛层析法是重组人抗HBsAg Fab抗体的最佳纯化方法,这为抗HBsAg Fab抗体的产业化生产和临床研究打下良好基础。     

新型抗uPAR人源化抗体的表达和活性检测

目的制备抗尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）人源化抗体并初步检测它们与抗原的亲和能力。方法通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗uPAR抗体的轻链和重链可变区基因序列,通过重叠PCR方法,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双向表达载体。瞬时转染293T细胞,收取细胞上清,rProtein A亲和层析法纯化目的抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,采用Biacore3000技术检测抗体与抗原的结合能力。结果成功构建5种表达载体S1~S5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和55×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合。Biacore3000实验结果表明,S2、S4和S5抗体与抗原具有良好的亲和活性,且亲和活性分别为1.74×10-8,1.49×10-8和1.05×10-8mol/L。结论成功构建并表达了5种抗uPAR人源化抗体,其中S2、S4和S5具有良好的抗原结合能力。     

抗HBsAg人VH基因中异常序列对抗体活性影响的研究

目的:我们曾从噬菌体抗体库中克隆到一株VH第3骨架区中含有异常序列的抗HBsAg人Fab基因,本工作拟探讨该VH基因中异常序列对抗体活性的影响.方法:采用重叠PCR方法去除这段异常序列,构建表达载体,转化大肠杆菌表达出抗HBsAg噬菌体抗体和可溶性Fab,测定了它们与抗原的结合活性.结果:与原抗体比较,改造后的抗体与抗原的结合活性明显下降,分子模建提示这段异常序列对VH CDR_1和CDR_2的部分氨基酸残基的位置有一些影响,测定改造前Fab的亲和力约为0.55×10~9M~(-1),改造后Fab因抗原结合活性过低,无法检测其亲和力.结论:提示这段异常序列在体内就可能存在于该VH之中.     

基因工程人抗角蛋白抗体对角质形成细胞增殖的影响

目的：研究一株基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体在无血清培养的角质形成细胞中的免疫学活性，观察其对角质形成细胞增殖的影响。方法：利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的质粒转化大肠杆菌，异丙基-D-硫代半乳糖苷(Pm)诱导表达出Fab抗体，用免疫组化观察对角质形成细胞的反应性，免疫印迹法检测所识别的角蛋白组分及用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测定对细胞增殖的影响。结果：基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体仅识别角质形成细胞中相对分子质量为46000的角蛋白区带，呈现为一条很强的染色带；免疫组化染色呈明显胞浆阳性；该抗体明显抑制培养的角质形成细胞增殖，并且存在剂量依赖关系。结论：特异性抗相对分子质量为46000的基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体可能是角蛋白抗体家族中影响角质形成细胞增殖的有效成分。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

兔抗鼠单克隆乙型肝炎核心抗体独特型的研究

自从提出免疫网络学说以来,抗独特型(anti-idio-type,简称抗Id)的研究受到重视。我们用小鼠单克佳抗-HB_c(MC抗-HB_c)IgG及其Fab片段免疫家兔进行特异性抗Id制备。为了连续观察免疫过程中动物产生抗Id的状况,建立了两种特异检测抗Id的方法,即ELISA中和法和抗原-抗体结合抑制法,来测定一系列稀释的待检兔血清中抗Id水平。前法系在待检兔血清中加入正常Balb/c小鼠(NBM)IgG中和掉抗同种型和同种异型抗体从而单独检出抗Id,如不加中和抗原即可检出抗鼠IgG/Fab的总抗体水平;后法是将待检标本与酶标记Id抗体共同温育,如标本中存在抗Id即可抑制Id抗体与抗原HB。Ag的结合。用兔抗鼠IgG做对照试验证实上述两法可以排除抗同种型和同     

新型抗EGFR人源化抗体基因的构建和表达

目的：构建并表达进一步人源化且效果显著增强的抗EGFR抗体。方法：通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗EGFR抗体的轻链和重链可变区序列,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双表达载体。瞬时转染293T细胞,用rProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定。采用Biacore3000技术检测抗体结合抗原的能力;细胞侵袭实验初步检测抗体的功能。结果：成功构建3种不同突变体表达载体C2、C3和C5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和50×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合。Biacore3000实验结果表明,C3抗体与抗原具有良好亲和活性（亲和力为6.13×10-10mol/L）;细胞侵袭实验结果表明,C2和C3抗体对肿瘤细胞生长迁移均具有一定的抑制作用。结论：成功构建、表达了3种抗EGFR人源化抗体C2、C3和C5,其中C3具有良好的抗原结合能力和抑制肿瘤细胞生长迁移能力。     

重组毕赤酵母菌高密度表达人源抗-HBs Fab抗体的研究

目的探讨抗-HBsFab抗体发酵工程菌GS115／Fab的高密度发酵及对发酵产物的纯化与活性鉴定方法。方法采用补料分批培养方法,在5L发酵罐中对发酵工程菌GS115／Fab进行高密度发酵,发酵温度28～30℃,pH值范围为5．0～5．5,溶氧范围20％以上;3次发酵分别于OD600值达到400～450、200～250、300～350时开始诱导,甲醇诱导浓度为0．5％～1％,经96h左右的诱导后终止发酵,对发酵上清进行亲和纯化,并通过ELISA法对纯化产物进行活性鉴定。结果在OD600为300～350时开始诱导有利于发酵过程条件的控制和目的蛋白的表达,目的蛋白表达量为245mg／L。发酵上清通过亲和层析纯化,获得纯度为98％的重组Fab抗体,该抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力及特异性。结论Fab酵母菌工程菌在5L发酵罐高密度发酵成功,为抗-HBsFab抗体的产业化生产及临床研究奠定了基础。     

轻链替换文库对抗HBs基因工程Fab抗体亲和力的影响

目的测定轻链替换文库对基因工程Fab抗体的亲和力的影响。方法将PCR扩增的人抗体轻链基因插入已克隆有人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体重链Fd基因的噬菌粒中,构建成轻链替换文库,经亲和淘洗,从该文库中筛选与重链Fd基因相匹配的轻链基因。结果链替换的噬菌体抗体(phab)的ELISA光吸收值(A)从0·43±0·09提高到最高为1·24±0·10。序列分析ELISA光吸收值(A)最高的5株phab的轻链基因,3株κ链的碱基序列基本一致,属VκIII亚群,2株λ链的基因序列相同,属VλⅠ亚群。结论所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。     

新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测

目的：制备新型人源化抗CD20单克隆抗体并检测其与CD20抗原的亲和力和抗肿瘤活性。方法通过计算机模建技术,在蛋白质结构数据库中找到与利妥昔单抗（ rituximab）空间结构最相近的人IgG1为骨架,将利妥昔单抗的互补决定区（ complementarity determining region ,CDR）进行移植和改造,通过重叠PCR方法,扩增出目的基因片段。分别将轻链（L）、重链（H）基因片段克隆到载体pcDNA3．3、pOptiVEC质粒上。瞬时转染至293F细胞,收取细胞上清,用rProteinA亲和层析法纯化目的抗体,并用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检验抗体的纯度和表达量,采用Fortebio技术检测抗体与抗原的结合能力,最后通过裸鼠移植瘤生长抑制实验检测抗体的抗肿瘤活性。结果构建了3种抗CD20人源化抗体。抗体在还原SDS-PAGE中表现为两条相对分子质量约为25×103和55×103的条带,与预计条带大小相符;Fortebio实验结果表明,3组抗体与抗原具有良好的亲和活性：利妥昔单抗、L4H7抗体、L5H5抗体和L5H7抗体的Kd值分别为6．48×10－9、1．91×10－9、7．35×10－10和1．91×10－9 mol／L。裸鼠移植瘤生长抑制实验表明,L5H7抗体的抗肿瘤活性优于利妥昔单抗。结论成功构建并表达了3种抗CD20人源化抗体,其中L5H7抗体具有良好的抗原结合能力和抗肿瘤活性。     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗盐酸克仑特罗(clenbuterol ,CL)的单克隆抗体并进行免疫学特性鉴定.方法:用重氮化法将盐酸克仑特罗偶联于载体牛血清白蛋白(BSA),形成的结合抗原BSA-CL作为免疫原免疫BALB/c小鼠,同时将CL与卵清白蛋白(OVA)偶联制备检测原(OVA-CL).应用杂交瘤技术建立分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水并进行纯化.用竞争性ELISA法测定抗体的亲和常数及交叉反应性.结果及结论:获得了18株稳定分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,挑选其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高亲和力的细胞株进行免疫学特性鉴定.三株抗体的亚类均为IgG1.细胞上清的间接ELISA效价分别为1:1 280、1:1 000、1:800,三株腹水效价都约为1×10-6.亲和常数分别为2.4×10-8mol/L、2.83×10 -8 mol/L 、3.28×10-8 mol/L .E9-C11单抗对CL的IC50为6.1035μg/L;对沙丁胺醇的IC50大于781.25 μg/L,交叉反应性小于0.78%;对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、莱克多巴胺及部分维生素和抗生素均无交叉反应性.蛋白免疫印迹分析证明三株单抗特异性均很高,可用于与其相关的免疫检测或应用研究.     

重组融合蛋白Fab/IFN-αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用

IFN-αA是治疗乙型病毒性肝炎有效药物,但由于其临床应用的副作用及持久应答率不超过50%,限制了其疗效的发挥[1].作者通过DNA重组技术和PCR技术将抗乙型肝炎表面抗原抗体片段Fab与IFN-αA在分子水平上进行重组,构建了人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αΑ-干扰素融合蛋白原核表达载体[2].本实验将筛选出阳性克隆的菌种进行诱导表达,测定表达的重组融合蛋白(Fab/IFN-αA)的IFN-αA活性及抗体Fab活性,并应用HBV DNA转染细胞系(HepG2215细胞系)作模型[3],通过检测Fab/IFN-αA作用后细胞上清液的HBsAg、HBeAg水平的变化,结合细胞存活率来评价其抗HBV作用,并与IFN-αA进行了比较.     

BA-ELISA法测定人粪便特异抗体

本文建立了 BA-ELISA 法检测人口服痢疾菌苗后粪便特异抗体,对影响测定的因素进行了观察,并确定了最适测试条件。用痢疾菌超声破碎抗原包板,用 PBS 稀释粪便抗体,生物素标记的羊抗人 IgA(IgG)作为第2抗体,用 avidin-HRP 为显色系统。其板内、批间变异系数在5%～8%之间。并初步用于粪抗体的检测,测定粪特异抗体的4倍升高率为50%～80%。因此,为评价口服痢疾双价菌苗免疫原性提供了可靠方法。     

用协同凝集试验检查布氏杆菌的实验研究

金黄色葡萄状球菌蛋白A(简称SPA),能吸附人及某些动物血清IgG抗体Fc端,而使抗体Fab端暴露,后者仍可与相应抗原结合,出现凝集现象。这一现象对检查各种病原体具有特异、快速、敏感、微量、少料等特点。根据这一原理,已制成多用途试剂。1973年Kronvall将肺炎双球菌抗体吸附在含有A     

人抗HBsAg Fab段基因的序列分析及表达

本文对已建的噬菌体抗体库中分离的人抗HBsAg克隆进行了序列分析和表达研究,发现19个克隆都具有相同的重链可变区基因,轻链可变区基因有4个相同,其余15个未进行序列测定.DNA序列分析表明 V_H、J_H分属V_HⅢ和J_H6,D对段为二个D基因的融合,V_k,J_k属于V_kⅠ和J_k4.构建了可溶性Fab段表达载体,发现在细菌培养上清和质周腔中有类似的表达,其表达量约为5ug/ml,与HBsAg可特异性结合,经测定其亲和系数约为0.5×10~9M~(-1).