TRIM69可抑制紫外线和依托泊苷刺激时HeLa和HEK293T细胞系内活化型caspase7和剪切型PARP的表达

目的验证TRIM69蛋白是否能够抑制He La和HEK293T细胞系内活化型caspase7(cleaved caspase7)和剪切型PARP(cleaved PARP)的蛋白水平。方法构建含人源TRIM69的真核表达质粒,转染He La细胞和HEK293T细胞,筛选稳定表达TRIM69的细胞系,通过紫外线照射和凋亡诱导剂依托泊苷(etoposide)刺激处理,Western blot检测细胞内TRIM69蛋白、活化型caspase7和剪切型PARP蛋白水平的变化。结果紫外线照射和依托泊苷刺激后,与对照组相比,TRIM69过表达的细胞内活化型caspase7和剪切型PARP的蛋白水平均下降(P0.05)。结论TRIM69蛋白的表达可抑制紫外线或依托泊苷刺激时He La和HEK293T细胞内凋亡相关蛋白活化型caspase7和剪切型PARP的蛋白水平。     

小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响

目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。     

人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。     

IFITM2的克隆表达及其抗病毒作用初探

目的:构建含有ifitm2基因的重组质粒,在人胚肾HEK293T细胞中表达,并验证IFITM2蛋白的抗病毒作用.方法:参照Genbank ifitm2基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR技术扩增ifitm2基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-simple载体上,目的基因测序正确后进一步亚克隆至真核表达载体pVAX1上,转染HEK293T细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)和激光共聚集显微镜(LCSM)验证外源基因在细胞内的表达情况.同时HEK293T细胞过表达IFITM2蛋白,利用含有EGFP基因的VSV-G假膜病毒感染细胞,通过Western blot检测IFITM2蛋白对病毒的抑制作用.结果:成功获得ifitm2基因,测序正确,将其连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,证明含有ifitm2基因的重组质粒构建成功,Western blot和LCSM分析表明,目的基因能够在HEK293T细胞中表达,且呈广泛分布.过表达IFITM2蛋白后,荧光蛋白分析表明,该蛋白对病毒感染具有一定的抑制作用.结论:成功构建了含有ifitm2基因的重组真核表达质粒,该质粒可以在真核细胞中得到有效表达,且对VSV-G假膜病毒具有一定抑制作用,该研究为进一步探讨IFITM2蛋白的抗病毒作用及其分子机制提供了实验及理论基础.     

Sirt2基因的克隆及其在HEK293中的表达

目的:克隆大鼠Sirt2 基因, 构建其真核表达载体并在HEK293细胞中表达.方法:利用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增出包含Sirt2编码区的cDNA片段, 产物纯化后T-A克隆连接至pMD20-T载体.以此为模板, 将该基因编码区克隆入真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)中, 转染HEK293细胞检测其表达.结果:测序证实所克隆的Sirt2编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his(-)中, 经免疫荧光检测证实其在HEK293细胞中得到表达.结论:成功克隆了大鼠Sirt2 cDNA, 构建了其真核表达载体, 并在HEK293细胞中得到有效表达, 为进一步研究大鼠Sirt2的功能奠定了基础.     

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活北大核心CSCD

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

人FAT10蛋白过表达诱导饥饿状态下HEK 293细胞发生凋亡

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态和饥饿状态下的HEK293细胞中的表达情况;并用XTT法和DNA ladder法观察正常培养和饥饿状态下HEK293细胞的凋亡情况。结果:重组质粒在HEK293细胞中高效表达,但在正常培养状态下和饥饿状态下表达情况不同。饥饿状态下,过表达FAT10的HEK293细胞存活率显著低于对照细胞,并且出现DNA ladder现象。结论:成功构建了带Flag标签的FAT10真核表达质粒,可在HEK293细胞中高效表达;FAT10过表达促进饥饿状态的HEK293细胞发生凋亡。     

长链非编码RNA CRNDE调控胶质瘤细胞凋亡

目的 探讨长链非编码RNA CRNDE在胶质瘤细胞凋亡中发挥的功能和可能的作用机制.方法 将CRNDE基因干扰siRNA转染人胶质瘤U87细胞系,利用PE Annexin-V/7-AAD双染,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并利用Western方法检测细胞凋亡关键蛋白的表达变化.结果 siRNA干扰CRNDE表达的胶质瘤细胞中,细胞凋亡程度增加,凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase7、Caspase9、PARP表达量明显升高.结论 CRNDE可能通过降低凋亡相关蛋白活性及表达水平,抑制胶质瘤细胞凋亡能力.     

线粒体凋亡途径参与表皮膜蛋白1诱导的细胞调亡

目的:探讨人表皮膜蛋白1(hEMP1)诱导细胞凋亡的信号途径.方法:构建包含hEMP1基因编码框的真核表达载体pcDNA3.1( )-EMP1,瞬转HEK293细胞后荧光倒置相差显微镜、流式细胞术检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活力以及线粒体膜电位的变化.结果:荧光倒置相差显微镜、流式细胞术结果显示,过表达EMP1后细胞Caspase-3、Caspasc-9活力显著增强.线粒体膜电位改变增多,而Caspase-8的活力变化不明显.结论:线粒体凋亡途径参与hEMP1诱导的细胞凋亡.     

miR-21通过PTEN/AKT减轻突变亨廷顿蛋白细胞毒性

目的探讨miR-21减轻突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin,mHtt)细胞毒性的机制。方法利用qRT-PCR检测miR-21在亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)转基因小鼠脑组织以及HEK293-160Q细胞中的变化;双荧光素酶实验检测PTEN是否为miR-21的靶基因;转染miR-21 mimics后,CCK8检测细胞活力,Caspase-3活性酶标检测Caspase-3活性,Western blotting检测PTEN、Ser-473位点磷酸化的AKT以及AKT。结果qRT-PCR结果显示,与野生型小鼠及HEK293-20Q细胞相比,HD转基因小鼠脑组织及HEK293-160Q细胞中miR-21均显著降低;双荧光素酶实验证实PTEN为miR-21靶基因;在HEK293-160Q细胞中转染miR-21 mimics后PTEN显著降低、p-AKT-Ser 473/AKT显著升高。结论miR-21能通过降低PTEN来提高p-AKT-Ser 473/AKT,减轻mHtt所引起的细胞毒性继而提高细胞活力、抑制细胞凋亡。     

Overexpression of wild-type presenilin 2 or its familial Alzheimer's disease-associated mutant does not induce or increase susceptibility to apoptosis in different cell lines

Programmed cell death, or apoptosis, has been implicated in Alzheimer's disease. Mutations in the presenilin (PS) genes, PS1 and PS2, are a major cause of early-onset familial Alzheimer's disease (FAD). Previous studies have suggested that the PS play a role in apoptosis. However, the mechanisms whereby presenilins affect apoptosis and the relationship of FAD-associated presenilin mutants to the apoptotic effect have not been elucidated. In the present study, in an attempt to further explore the effect of PS2 on apoptosis we examined whether overexpression of wild-type or mutant PS2 can directly induce apoptosis or increase cell susceptibility to apoptosis in various cell lines, such as N2a, CHO, and HEK 293T. Wild-type or mutant PS2 was transiently transfected into these cell lines and the viability of the transfected cells was evaluated by their morphology, DNA fragmentation and condensation, appearance of sub-G(1/0) cells, and caspase activation. We also examined the susceptibility of the PS2-transfected cells to apoptosis induced by the apoptotic inducers staurosporine and H(2)O(2). Our results showed that overexpression of either wild type or mutant PS2 in these cell lines did not directly induce apoptosis or increase the susceptibility to apoptosis induced by staurosporine or H(2)O(2). Taken together, these results suggest that overexpression of PS2 does not cause pro-apoptotic effects, at least not in the cellular systems and conditions employed in this study, and therefore it seems unlikely that apoptosis plays a prominent role in the neuropathological effects of PS2 in Alzheimer's disease.     

枸杞多糖通过泛素蛋白酶体途径降解突变亨廷顿蛋白

目的　探讨枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide,LBP）降解突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin,mHtt）的途径。 方法　在稳定表达mHtt 160Q的HEK293细胞中使用不同浓度LBP,CCK8法检测细胞活力,caspase-3活性酶标法检测caspase-3活性;使用荧光显微镜检测、Image Pro Plus 6.0分析LBP对HEK293-160Q细胞中mHtt的影响并同时使用RT-PCR法检测LBP是否影响其mRNA水平;使用LBP、MG132及氯喹,分组处理HEK293-160Q细胞,通过Western Blot法检测不同组细胞中mHtt的变化。 结果　LBP能提高HEK293-160Q细胞活力,降低caspase-3活性;LBP能减少细胞中mHtt且不改变其mRNA;不同药物处理HEK293-160Q细胞后,发现与只使用LBP相比,同时使用LBP与MG132会显著降低mHtt的降解,而同时使用LBP与氯喹则对mHtt的降解没有影响。 结论　LBP能通过泛素蛋白酶体途径降解mHtt,减轻mHtt所引起的细胞毒性继而提高细胞活力、抑制细胞凋亡。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。     

一种含多个CCP结构域的新型基因的克隆及生物学特性初探

目的克隆并分析新型基因CCP22，研究其结构及初探生物学特性。方法常规分子克隆、生物信息学分析、Western blot、RT—PCR。结果利用酵母双杂交技术从人乳腺文库中分离到一种含有22个补体调控蛋白（complement control protein，CCP）序列元件的新基因，命名为CCP22。生物信息学分析发现，该基因定位于人染色体9q31．2-32，共15个外显子，基因编码序列全长4494bp，编码1497个氨基酸。将CCP22基因全长编码序列克隆于真核载体中，该表达载体转染人胚肾细胞293T后获得的表达产物经Western blot证实CCP22属于分泌蛋白。将CCP22与绿色荧光蛋白（EGFP）标签融合后证实CCP22主要分布在细胞核外。Northern blot证实，内源性CCP22 mRNA转录本全长约6kb。RT-PCR检测表明，CCP22在正常乳腺细胞株中高表达，而在多种乳腺肿瘤细胞株中不表达或低表达。结论CCP22在乳腺肿瘤发生发展中可能发挥重要作用。     

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

FKBP12/BAX双聚体诱导细胞凋亡模型的建立

目的：建立FKBP12／BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型,并利用阳性药物对其进行鉴定。方法：RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因,插入pUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中,构建pC4FV1E／BAX表达质粒。将表达质粒与pcDNA3．1共转染HEK293细胞,建立pCAFV1E／BAX-neo和neo基因稳定表达的细胞模型。利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12／BAX双聚体介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析。结果：RT-PCR、Westem blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达;阳性化合物AP20187作用4～6h后,Giemsa染色可见明显的凋亡小体;钙依赖核酸内切酶亦被激活,出现典型的“DNA ladder”;天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡。结论：FKBP12／BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型的建立,为FK506类小分子化合药物的高通量筛选提供可应用的技术平台。