强的松增强 HBV 感染小鼠体内病毒复制表达

目的:检测糖皮质激素对HBV感染小鼠体内HBV复制的作用。方法:采用高压注射体内转染法将HBV复制型重组质粒p AAV/HBV1.2导入雄性C57BL/6小鼠,转染后24 h按体重、年龄、血清HBe Ag水平对小鼠进行配对,分为实验组和对照组,分别连续给予强的松或生理盐水灌胃。于第3天和第10天给药后4~6 h处死小鼠。采用Southern杂交检测小鼠肝脏HBV-DNA复制中间体;化学发光法检测血清中HBe Ag和HBs Ag。结果:对HBV感染小鼠连续给予强的松或生理盐水3 d后,所有小鼠肝脏中均可检测到较高水平的HBV-DNA复制中间体,给予强的松的实验组稍高于给予生理盐水的对照组,二者比值为1.127∶1;连续处理10 d后,实验组小鼠肝脏中HBV-DNA复制中间体的水平明显高于对照组,比值为2.534∶1。处理3 d后对照组和实验组小鼠血清HBs Ag平均值分别为:1 618.28μg/μL、1 666.23μg/μL,实验组与对照组无明显差别;小鼠血清对照组和实验组HBe Ag平均值分别为14.68μg/μL、14.95μg/μL,实验组对照组无明显差别;处理10 d后对照组和实验组小鼠血清HBs Ag平均值分别为:8 059.40μg/μL、11 885.87μg/μL,实验组高于对照组。小鼠血清对照组和实验组HBe Ag平均值分别为183.15μg/μL、286.14μg/μL,实验组高于对照组。结论:强的松可增强HBV感染小鼠体内乙肝病毒的复制和表达,并且随着作用时间的延长,作用也越明显。本研究为糖皮质激素及引起HBV再激活的相关研究奠定基础,同时也再次提醒临床医生,应充分重视糖皮质激素的使用中HBV再激活的问题。     

丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒转录与复制的实验研究

目的观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)对乙型肝炎病毒(HBV)基因转录和病毒复制的影响。方法将不同剂量的HCVcore表达质粒(pNKF-HC Vcore)转染HepG2.2.15细胞。以空载质粒(pNKF)转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照,转染HepG2细胞作为阴性对照。以Northern吸印杂交检测HBV mRNA的转录水平,以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA的复制水平。结果20μg pNKF-HCV core转染HepG2.2.15细胞后,可使细胞中HBV mRNA转录水平及HBV复制中间体DNA复制水平明显降低,抑制率分别为51.9%及36.5%。10μg及15μg pNKF-HCV core较pNKF转染的HepG2.2.15细胞的HBV mRNA信号与HBV复制中间体DNA检出信号强度无显著差异。结论HCV核心蛋白达到一定的剂量后能够在一定程度上抑制HBV的转录与复制。     

肝细胞核因子3β调控小鼠体内HBV转录和复制的实验研究

目的 应用复制型HBV小鼠模型观察肝细胞核因子3β(HNF3β)对小鼠体内HBV转录和复制的调控作用.方法 通过尾静脉高压注射法将复制型HBV重组质粒pHBV4.1和大鼠HNF3β表达质粒pCMVHNF3β导入小鼠体内,用Northern吸印杂交检测小鼠肝组织中HBV 3.5kb、2.4/2.1kb、0.7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平.结果 经小鼠尾静脉高压注射法体内转染质粒pHBV4.1后,小鼠肝组织中检测到HBV 3.5kb、2.4/2.1kbmRNA转录信号和HBV DNA复制中间体信号;与共转染pHBV4.1和空载质粒pCMVpA对照组相比,共转染pHBV4.1和pCMVHNF3β使HNF3β过量表达,明显降低了小鼠体内HBV RNA转录和DNA复制水平.结论 肝富集转录因子HNF3β对小鼠体内HBV转录和复制具有抑制作用,有可能成为今后抗HBV生物治疗新的靶点.     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.     

重型乙型肝炎的病毒复制状况

In order to elucidate the relationship between hepatitis B virus (HBV) replication and severity of hepatitis B, HBV serological markers and HBV-DNA in 56 patients with chronic hepatitis B were detected using the methods of ELISA and PCR, respectively. The results showed that the positive prevalence of HBeAg and/or HBV-DNA in chronic severe hepatitis B (5/25) was much lower than that in non-severe chronic hepatitis B (26/31) (P < 0.01). The study provides the suggestive evidence that viral replication is significantly reduced in severe hepatitis B. Also, increased replication of HBV appears to be not the cause of hepatic necrosis in severe hepatitis B.     

肝富集转录因子在HBV基因转录与复制中的作用研究

目的观察各种肝富集转录因子对乙型肝炎病毒（HBV）基因转录和病毒复制水平的影响,探讨其在HBV嗜肝性机理中的作用。方法用复制型HBV重组质粒pHBV4．1与肝富集转录因子HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、C／EBP或RXRa／PPARa的表达质粒,分别共转染非肝源细胞株NIH3T3、HeLa、293T、SWl353、CV-1和COSl。用Northern吸印杂交检测HBV3．5kb、2．4／2．1kb、0．7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果用pHBV4．1转染NIH3T3细胞后,在没有肝富集转录因子表达质粒共转染时未能检出3．5kb HBV RNA转录,也无HBV DNA复制;当用肝富集转录因子共转染时,HNF4和RXRα／PPARα的表达能够激活3．5kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF1、HNF3、HNF6和C／EBP未能激活HBV复制。在HeLa、293T、SW1353、CV-1和COS1细胞中,HNF4、RXRα／PPARα对HBV的转录和复制也具激活作用。进一步用突变型HBV重组质粒研究发现,C启动子HNF4结合位点的突变明显减弱了HNF4和RXRα／PPARα对HBV复制的激活作用。结论肝富集转录因子HNF4和RXRα／PPARα可支持HBV在非肝源细胞中的转录与复制;肝特异性基因转录是HBV嗜肝性的决定因素之一。     

重型乙型肝炎的病毒复制状况

为了解重型乙型肝炎时乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的复制状况，应用酶联免疫吸附实验和聚合酶链反应测定了５６例乙型肝炎病人的ＨＢＶ复制指标。慢性重型肝炎病人的ＨＢｅＡｇ和／或ＨＢＶ－ＤＮＡＰＣＲ阳性率明显低于非重型慢性肝炎（Ｐ＜０．０１），表明ＨＢＶ复制活跃不一定是重型肝炎发生的因素之一。进一步证明ＨＢＶ本身并无致肝细胞损伤作用     

HBV Pre-S1蛋白及HBV-DNA含量检测在诊断乙肝病毒复制中的临床意义

目的:探讨乙肝患者不同血清学标志物模式(HBV-M)与乙肝病毒DNA含量及乙肝病毒前S1蛋白的关系,为预测乙型肝炎病毒的传染程度、预防、诊断及治疗提供实验室依据。方法:采用ELISA法对1385例携带不同血清学标志物的乙肝患者进行HBVPre-S1和乙肝5项指标检测,并用聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA含量。结果:不同HBV免疫模式中HBsAg、HBeAg和HBcAb同时阳性,其HBV-DNA和HBVPre-S1的检出率分别为90.7%和71.1%;HBsAg、HBeAb和HBcAb阳性组的检出率分别为35.8%和27.3%;其他不同血清学模式组也有不同的阳性率。结论:HBV-DNA、乙肝病毒5项标志和HBVPre-S1联合检测,对HBV感染早期诊断,了解病毒的复制情况,疗效观察和预后判断均具有重要意义。     

慢性乙肝患者肝纤维化乙肝病毒复制水平的检测

目的探讨慢性乙肝患者肝组织纤维化与乙型肝炎病毒复制水平之间的关系。方法按HBV—DNA检测,分为阴性组94例、阳性组86例,采用核酸扩增荧光定量（FQ—PCR）检测HBV—DNA,放射免疫分析（RIA）检测肝纤维化标志物肝胆酸（CG）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原肽（PCⅢ）、四型胶原（Ⅳ—C）和层黏连蛋白（LN）。结果慢性乙肝患者HBV—DNA复制水平增高,血清肝纤维化标志物含量亦增高（P〈0．05,P〈0．01）。结论慢性乙肝患者乙型肝炎病毒复制水平增高可促使肝组织纤维化,抗病毒治疗、清除和控制病毒复制对阻止肝组织纤维化有益。     

深圳地区慢性HBV感染者血清中HBx基因多态性分析

目的:研究HBV感染者血清学模式与HBx基因多态性的关系。方法:采用聚合酶链反应、单链构象多态性和异源双链分析的方法对HBV感染者血清中HBx基因进行多态性分析。结果:在HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)和HBsAg(+)/HBcAb(+)血清学模式中,HBx基因双链区(nt1595-1881)多态性不明显(P(0.05),带形基本一致;HBx基因单链区(nt1365-1625)多态性明显,HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式PCR扩增产物条带数与HBsAg(+)/HBcAb(+)模式相比,差异显著(P(0.05)。结论:慢性HBV感染者不同血清学模式HBx基因存在多态性,其多态性主要表现在HBx基因单链区。     

乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达

目的：构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达。方法：从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind〖KG-*3〗Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达。结果：PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达。结论：成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础。     

Expression of cytokines in mouse hepatitis B virus X gene-transfected model

The expression profile in the mouse hepatitis B virus X (HBx)-transfected model was investigated in order to lay a foundation for further study on the implication of cytokines expression in hepatitis B virus (HBV) infection.Hydrodynamic injection method via the tail vein was used to establish the animal HBx-transfected model.By using microassay,the differential expression of gene in each group was analyzed,which was further confirmed by using real-time PCR and semi-quantitative PCR.Most of chemokine genes such as Ccl2,Ccl5,Ccl9,MIG and IP-10 were up-regulated in the HBx-transfected mouse model versus the control mice,which was coincided with the microarray results.Western blotting and immunohistochemistry were applied to detect the expression of MIG and IP-10 in the liver tissues.Simultaneously,ELISA was adopted to measure the content of IFN-γ in the liver tissues.DNA microassay revealed that the expression of 611 genes changed in HBx-transfected mice as compared with that in pCMV-tag2B-transfected mice,and most of the screened chemokines were up-regulated (including MIG and IP-10).Additionally,IFN-γ protein levels were increased by 20.7% (P<0.05) in pCMV-tag2B-HBx-transfected mice as compared with the untreated mice.IFN-γ protein levels were reduced by 53.9% (P<0.05) in pCMV-tag2B-transfected mice as compared with the untreated mice,which was consistent with the up-regulation of MIG and IP-10.It was suggested HBx transfection could induce the expression of MIG and IP-10 in the liver tissues,which might play the roles in HBV-related liver immunity and cytokines-mediated antiviral effect.     

乙肝病毒X蛋白对油酸钠诱导HepG2细胞脂质沉积的影响

目的探讨乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)是否增加油酸钠诱导HepG2细胞的脂质沉积。方法将质粒pIRES2-eGFP-HBx瞬时转染入HepG2细胞中,建立表达HBx的细胞模型(HepG2-HBx);以转染空载体pIRES2-eGFP(HepG2-pIRES2)和HepG2细胞(HepG2)作对照。观察转染后绿色荧光蛋白(GFP)的表达;转染后16 h开始用油酸钠处理各组细胞24、48 h(分别命名为HBx/OA组、空/OA组、G2/OA组),细胞内甘油三酯(TG)含量测定及油红O染色了解细胞内脂质沉积情况;在油酸钠处理细胞24 h,RT-PCR法检测SREBP-1和LXRα的mRNA表达水平,Westernblot检测HBx、LXRα及FAS蛋白表达水平。结果转染后16 h HepG2-HBx细胞和HepG2-pIRES2细胞中开始有GFP的表达,提示转染成功;仅在HepG2-HBx细胞内有HBx表达,表明HepG2-HBx细胞模型构建成功。在相同油酸钠处理的条件下,HBx/OA组细胞内脂质含量和TG含量与对照组相比均明显增加(P<0.01)。在油酸钠处理细胞24 h,HBx/OA组细胞内LXRα、SREBP-1的mRNA表达量和LXRα、FAS蛋白表达量较对照组均明显增加(P<0.01/0.05)。结论 HBx通过上调HBx-LXRα-SREBP1/FAS通路脂质合成相关基因表达,可能增加HepG2-HBx细胞对外界脂代谢紊乱因素的易感性,从而增加油酸钠诱导HepG2细胞脂质沉积。     

孕妇血清中乙型肝炎病毒复制水平与胎儿宫内感染的关系

目的 探讨孕妇血清中乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBeAg)、前S1抗原(Pre-S1Ag)和病毒DNA(HBV-DNA)与胎儿宫内乙型肝炎病毒感染的关系.方法 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对165例乙肝表面抗原(HBsAg)阳性孕妇的母血及产后婴儿外周血的乙型肝炎血清学标志物(HBV-M)和HBV-DNA进行检测.结果 165例HBsAg阳性孕妇血清中HBeAg、Pre-S1Ag和HBV-DNA的检出率分别为29.1%、31.5%和38.2%,所生婴儿外周血中HBsAg和HBV-DNA的检出率分别为7.3%(12/165)和23.6%.HBeAg、HBVPre-S1Ag和HBV-DNA阳性孕妇所生婴儿外周血HBV-DNA的检出率分别为79.2%、75.0%和66.7%,显著高于HBeAg、Pre-S1Ag和HBV-DNA阴性者的5.1%、6.2%和0.0%,(P＜0.01).孕妇血清中平均HBV DNA的含量为(7.32±1.79)(拷贝数/mL的对数),显著高于婴儿外周血HBVDNA的(5.86±1.33),(P＜0.01),婴儿外周血中HBV DNA阳性率随孕妇HBV DNA含量增加而显著增加,且呈正相关(r=0.43,P＜0.01).结论 孕妇血清中HBeAg、Pre-S1Ag和HBV-DNA阳性是胎儿宫内感染HBV的高危因素,胎儿宫内感染率随母血中HBV-DNA含量增加而增加.     

乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性

 目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒（HBV）X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系。方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象,20例HBV相关性肝细胞癌作为对照;HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序。免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量。结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。nt1725～1730（aa118/119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006）,和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关,尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显;相反,nt1762/1764（aa130/131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。同时,肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎（P<0.05）,而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高（P<0.01）。结论 肝组织内,在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平,nt1762/1764突变则相反。肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关