非胰岛素依赖型糖尿病与胰岛素基因实验研究

从非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM）患者外周血的白细胞中提取DNA．以胰岛素基因5’－末端上游的某一DNA序列为引物，对特定的靶序列进行体外扩增，即TaqDNA聚合酶链反应（PCR），将其扩增产物进行电泳分离，在紫外分析仪下观察结果并与正常人对照，发现16例NIDDM的M患者胰岛素基因有所改变，提示此型糖尿病患者的胰岛素基因改变可能是导致NIDDM遗传因素之一。     

变性高效液相色谱检测IRS-2基因3′-非翻译区单核苷酸多态性

目的 :探讨变性高效液相色谱 (DHPLC)在胰岛素受体底物 2 (IRS 2 )基因 3′ 非翻译区单核苷酸多态性 (SNP)检测中的应用。方法 :采用聚合酶链式反应 (PCR) ,DHPLC ,单链构象多态性 (SSCP)和DNA序列分析对 30例正常对照和 30例 2型糖尿病患者IRS 2基因 3′ 非翻译区进行SNP和突变检测。结果 :PCR DHPLC检测出 4例PCR SSCP分析未能发现的 2型糖尿病患者IRS 2基因 3′ 非翻译区的SNP ,并得到测序验证。结论 :DHPLC是一种快速、自动化程度高、操作简单、检测片段长、准确率高的SNP检测技术。它为进一步研究IRS 2基因 3′ 非翻译区的变异与 2型糖尿病的关系奠定了基础。     

变性高效液相色谱检测IRS-2基因3′-非翻译区单核苷酸多态性

目的：探讨变性高效液相色谱(DHPLC)在胰岛素受体底物-2(IRS-2)基因3′-非翻译区单核苷酸多态性(SNP)检测中的应用。方法：采用聚合酶链式反应(PCR)，DHPLC，单链构象多态性(SSCP)和DNA序列分析对30例正常对照和30例2型糖尿病患者IRS-2基因3′-非翻译区进行SNP和突变检测。结果：PCR-DHPLC检测出4例PCR-SSCP分析未能发现的2型糖尿病患者IRS-2基因3′-非翻译区的SNP，并得到测序验证。结论：DHPLC是一种快速、自动化程度高、操作简单、检测片段长、准确率高的SNP检测技术。它为进一步研究IRS-2基因3′-非翻译区的变异与2型糖尿病的关系奠定了基础。     

β3 肾上腺能受体基因多态性分析及其初步应用

目的：建立β３－肾上腺能受体基因多态性检测方法。了解其表型行征。方法：应用ＰＣＲ－限缺性片段长度多态性ＰＣＲ－双脱氧链终止法测序技术分析β３－肾上腺能受体（β３－ＡＲ）基因型,结果：４８例北方汉族糖尿病人和３２例正常对照者中均存在β３－ＡＲ基因１９０位Ｔ→Ｃ的单碱基变异,两组人群中基因型的构成比例无显著差异。结论：Ａｒｇ６４Ａｒｇ纯合子可能具有糖尿病早发的特点。但β３－ＡＲ基因不是造成肥胖、脂质紊     

具有靶向作用的人类胰岛素原表达载体的构建与鉴定

目的构建能够靶向作用于大鼠胰岛细胞的绿色荧光蛋白及人类胰岛素原表达载体,为糖尿病的特异性基因治疗奠定基础。方法采用PCR法从SD大鼠全血基因组中扩增大鼠胰岛素I启动子（RIP）片段,将其克隆至pIRES2-EGFP质粒载体的启动子位点,用重叠延伸PCR法从人类全血基因组DNA扩增获得人类胰岛素原基因片段,插入pIRES2-EGFP质粒载体的多克隆位点,构建大鼠胰岛素I启动子驱动的人类胰岛素原及绿色荧光蛋白表达载体。结果构建的RIP-人类胰岛素原及绿色荧光蛋白表达载体经酶切及测序结果均正确。结论构建了受大鼠胰岛素I启动子驱动的人类胰岛素原及EGFP表达载体,为开展糖尿病的特异性基因治疗奠定了基础。     

套式PCR检测细菌16SrRNA基因

目的　应用套式PCR建立快速检查方法来检测血液中是否含有细菌。方法　采用细菌 1 6SrRNA基因通用引物 ,通过套式PCR方法对细菌进行扩增 ,并对其灵敏度、特异性作一评价。结果　临床常见细菌扩增反应为阳性 ,其他病原微生物及人类基因组DNA为阴性。结论　本法具有敏感、快速、特异、准确的优点 ,是一种可靠的实验手段     

胰岛素受体底物—1基因3′非翻译区的突变与中国人2型糖尿病的关系

目的：研究胰岛素受体底物－1（IRS－1）基因3′非翻译区的突变与中国2型糖尿病的关系。方法：采用PCR－SSCP技术扫描120例中国2型糖尿病患者和120例正常对照的IRS－1基因3′非翻译区序列，所有SSCP变异的样品进行DNA测序分析。结果：SSCP分析存在假阳性结果。测序未发现有基因突变。结论：IRS－1基因3′非翻译区的突变不是引起中国人2型糖尿病的重要遗传因素。     

合成人降钙素基因实验研究的初步报告

目的 :合成含人胰岛素分泌信号的人降钙素基因。方法 :将人胰岛素分泌信号和人降钙素基因的序列分成六个片断合成单链寡核苷酸作为PCR的引物和cDNA合成的模板。应用动态模板PCR反应直接扩增出人胰岛素和降钙素的编码序列。结果 :经含EB的 1.5 %琼脂糖凝胶电泳 ,证明合成的基因含编码人胰岛素分泌信号和人降钙素的全长DNA序列。结论 :本研究为基因合成提供了一种新的可靠方法。     

Construction of human insulin gene expression recombinant and its effect on blood glucose of diabetic rats

OBJECTIVE To study the effect of human insulin gene modified fibroblasts on blood glucose in diabetic rats.

METHODS An expression vector containing human insulin gene was constructed by recombinant DNA technique and introduced into fibroblast Ltk- cells by lipofectin-mediated DNA transfection. Following G418 screening, the survived cells were selected and enriched. Finally a cell line, PRI-12 was generated for the highest insulin production. Then, these cells were injected into streptozocin (STZ)-induced diabetic rats.

RESULTS Insulin DNA transfected Ltk- cells were able to express insulin at a high level in a long-term culture. Furthermore, these Ltk- transfectants could decrease blood glucose significantly (P < 0.01) and obviously increase the body weight (P < 0.01) when they were injected into STZ-induced diabetic rats.

CONCLUSIONS These results suggest that the cell lines transfected insulin gene could secrete insulin and execute effect on diabetic rats. The study provides support for the view that somatic cell gene therapy offers a potential approach to delivery insulin into diabetes mellitus.

     

大鼠胰岛素原基因转染肠道上皮细胞构建类胰岛B细胞系的研究

目的观察重组大鼠胰岛素原基因转染小鼠肠道上皮细胞(IEC-6)后,IEC-6的胰岛素表达情况。方法将IEC-6分为重组大鼠胰岛素原基因pCMV/proinsulin转染组(A组)、空载质粒pCMV转染组(B组)和未转染组(C组)。利用脂质体法将pCMV/proinsulin和pCMV分别转染IEC-6,用RT-PCR法检测转染后IEC-6胰岛素原基因mRNA的表达,并用超敏放免法测定转染后IEC-6的胰岛素表达水平。结果pCMV/proinsulin转染IEC-6后,IEC-6能表达胰岛素原基因mRNA。3组IEC-6表达的胰岛素水平间差别有统计学意义(P<0.05)。A组IEC-6胰岛素表达水平与B组、C组比较,差别有统计学意义(P<0.001);B组IEC-6胰岛素表达水平与C组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。结论重组大鼠胰岛素原基因能成功转染小鼠肠道细胞并分泌胰岛素,为开展糖尿病基因治疗的研究奠定了实验基础。