骨髓间充质干细胞在mdx鼠体内分化为骨骼肌细胞及其dystrophin/utrophin蛋白的表达

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)移植入放疗的mdx鼠后dystrophin/utrophin的表达变化.方法 将BrdU标记的大鼠P5代MSCs移植入放疗处理的mdx鼠,分别于移植后4、8、12和16周断头处死取其腓肠肌,冰冻切片应用免疫荧光、RT-PCR及Western blotting检测BrdU/dystrophin及utrophin的表达变化.另分别取5只正常C57BL/6鼠和mdx鼠作阳性和阴性对照.结果 经γ射线放疗预处理的mdx鼠,在尾静脉移植MSCs后4周时肌纤维抗肌萎缩蛋白的表达少于1%,随移植时间延长增加,16周时为15%,dystrophin/BrdU激光共聚焦免疫荧光显示肌细胞核中移现象较同龄mdx鼠对照组减少,边居增多.RT-PCR及Western blotting检测到dystrophin表达也随移植时间延长增多.移植后mdx鼠肌细胞膜utrophin表达较对照组mdx鼠减少,RT-PCR结果显示mRNA在移植前后没有明显改变.结论 MSCs移植后mdx鼠的肌细胞膜有dystrophin表达,激光共聚焦技术表明dystrophin阳性肌纤维部分来自于移植的MSCs.utrophin在mdx鼠肌膜上表达上调,MSCs移植后dystrophin表达对utrophin有一定的抑制作用,两者存在互补关系.     

亚致死量放疗对Duchenne型肌营养不良鼠骨髓干细胞移植的影响

[目的]研究7 Gy γ射线放疗对Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)骨髓干细胞移植的效果。[方法]获取4~5周昆明鼠的骨髓干细胞,体外培养3 d,移植给7 Gy剂量放疗的7~8周的mdx鼠。22只7 Gy剂量放疗的肌营养不良鼠鼠,随机分为A、B、C、D 4组;A、B、C每组6只,静脉移植骨髓干细胞数为A组:1.2×106/只、B组4.8×106/只、C组1.2×107/只。D组4只作空白移植对照。观察受体鼠存活率,临床监测移植物抗宿主病(GVHD)情况;移植12周后,检测受体鼠肌组织抗肌萎缩蛋白表达情况。[结果]移植3个月后,22只实验鼠全部存活,18只移植鼠有近9％肌纤维表达dystrophin蛋白。[结论]移植前给予7 Gy γ射线放疗照射mdx鼠,部分破坏受体骨髓造血系统后,静脉注射移植同种、非同系鼠的骨髓干细胞,3个月之后,受照射鼠实现了100％存活;且移植鼠均有抗肌萎缩蛋白表达。     

骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理及Dystrophin的表达变化

【目的】研究骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌组织病理变化及dystrophin的动态表达变化。【方法】7～9周mdx鼠20只平均分为4组,放疗后移植1.2×107个/只同种异基因全骨髓干细胞,于移植后4周、8周、12周及16周应用HE染色观察细胞形态及核中心移位(CNF),免疫组化及Westernblot方法检测dystrophin表达变化,C57鼠和未治疗mdx鼠各5只作阳性和阴性对照。【结果】C57鼠腓肠肌横切面可见肌细胞大小形态基本一致,无核中移现象。各细胞移植治疗组和对照组mdx鼠均有大量的炎细胞浸润,核中心移位明显。未治疗mdx鼠CNF最高,可达70%左右,移植后4周、12周和16周,CNF比例分别为55%、50%和44%。免疫荧光结果C57鼠肌膜呈完整的网状绿色荧光,mdx鼠肌膜基本未见绿色荧光;移植后4周肌膜dystrophin阳性纤维数大约占细胞总数的1%,随时间延长表达渐渐增多,8周、12周和16周时阳性细胞数分别占细胞总数的5%、10%和15%。Westernblot结果mdx鼠无dystrophin的表达,野生型C57鼠表达量最多,移植后4周mdx鼠仅见微弱表达,随时间延长表达量渐增,移植后16周表达量较移植8周明显增加。【结论】骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌CNF随移植时间延长逐渐减少,dystrophin的表达随时间延长增多,提示骨髓干细胞移植后长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

人骨髓间充质干细胞能部分修补mdx鼠膈肌肌膜

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(bBM-MSC)移植mdx鼠后是否能修补膈肌肌膜.方法 用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记hBM-MSC,将1×10~7个干细胞(0.3mL)经尾静脉注入免疫抑制的mdx鼠(8～10周龄)体内.于移植后2、4、8、12、16、20及24用处死mdx鼠,用免疫组化法检测膈肌的病理变化、BrdU阳性细胞核数及人细胞核(Hu)与人抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达,RT-PCK检测人Dys mRNA的表达.结果 移植mdx鼠膈肌核中心移位纤维比例较未移植mdx鼠显著减少(P<0.05) .移植后2周膈肌可检测到少量BrdU阳性细胞核,8周后膈肌的BrdU阳性细胞核数逐渐增加.移植后2周膈肌检测到少量人特异性抗核(anti-Ha)抗体阳性细胞核,4周后在膈肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后有Dys mRNA的表达;随着移植时间的延长,anti-Hu抗体阳性细胞核数和Dys阳性细胞比例逐渐增高,Dys mRNA的表达逐渐增强.结论 hBM-MSCs可在mdx鼠膈肌分化为肌细胞,能减轻膈肌的病理,部分修补膈肌肌膜.     

人骨髓间充质干细胞在mdx鼠体内的动态分布

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在mdx鼠体内的动态分布特点。方法用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记hBM-MSCs,将1×107个干细胞(0·3ml)经尾静脉注入免疫抑制的mdx鼠(8~10周龄)体内。于移植后48h、2、4、8、12、16、20、24周处死鼠,用免疫荧光法检测各组织器官的BrdU阳性细胞核数、骨骼肌人细胞核(Hu)及人抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达,RT-PCR检测人Dys mRNA的表达。结果移植后4周内,BrdU阳性细胞核可见于多数组织、器官,其中以骨髓、肝、肺较多;肝、肺BrdU阳性细胞核数4周后逐渐下降;移植后48h骨髓BrdU阳性细胞核数较多,2周最多,16周后仍维持较高水平;4周后骨骼肌的BrdU阳性细胞核数逐渐增加。移植后2周骨骼肌检测到少量人特异性抗核抗体(anti-Hu)阳性细胞核,4周后在骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后有Dys mRNA的表达;随着移植时间的延长,anti-Hu抗体阳性细胞核数和Dys阳性细胞比例逐渐增高,DysmR-NA的表达逐渐增强。结论hBM-MSCs移植mdx鼠后早期(2~4周)主要分布在骨髓、肝、肺,后期(4周后)主要分布在骨髓、骨骼肌。     

异体骨髓干细胞移植后假肥大型肌营养不良症模型鼠膈肌dystrophin表达及病理改变

目的探讨骨髓干细胞移植对假肥大型肌营养不良症(DMD)模型鼠-mdx鼠膈肌的治疗效果。方法取雄性SD大鼠骨髓干细胞经尾静脉植入放疗处理后的8周龄雌性mdx鼠(n=18)。于移植后4、8、12周各取6只mdx鼠的膈肌行 HE染色、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)免疫荧光检测以及dystrophin mRNA的RT-PCR分析,同时用正常C57鼠及放疗而未移植的mdx鼠作为对照,另进行PCR反应检测实验鼠膈肌内Sry(Y染色体的性别决定区)基因。结果移植后mdx 鼠膈肌间质内炎性细胞浸润较放疗而未移植mdx鼠有所减少;移植后核中心移位纤维比例[移植后4、8、12周分别为 (15．58±0．91)％、(12．50±1．87)％、(10．17％±1．17)％]较未移植mdx鼠(19．5±1．87)％显著减少。移植后dystrophin免疫荧光阳性细胞比例[移植后4、8、12周分别为(1．00±0．32)％、(6．00±1．05)％、(11．92±1．11％)]较未移植mdx鼠(O．17±0．41)％显著增加。RT-PCR结果显示C57鼠膈肌的dystrophin mRNA相对含量(0．63±0．04)最高;而未移植mdx鼠的膈肌中未检测到dystrophin mRNA;移植后的mdx鼠膈肌中mRNA的表达水平(移植后4、8、12周分别为0．19±0．05、0．26±0.06、0．36± 0．04)随时间推移逐渐增高;移植后各时间点mdx鼠膈肌Sry基因均为阳性。结论骨髓干细胞系统移植mdx鼠可以恢复部分膈肌的dystrophin表达,改善膈肌的病理,骨髓干细胞移植有希望成为全身治疗DMD的有效方法。     

骨髓干细胞移植对dystrophin/utrophin基因双敲除鼠骨骼肌微观结构的影响

[目的]研究骨髓干细胞移植对Duchenne型肌营养不良(DMD)鼠(dko鼠)的骨骼肌微观结构的影响.[方法]获取4～5周龄C57BL/6鼠骨髓干细胞,体外培养3 d,以1.2×107个细胞/只静脉移植到7 Gy γ射线预处理的6只dko鼠(7～8周龄).8周后,检测移植鼠肌肉组织dystrophin蛋白表达、显微以及超微结构改变,并比较两组生存期.[结果]6只dko鼠骨髓干细胞移植8周后,约有7%骨骼肌肌纤维表达了dystrophin蛋白,骨骼肌组织的显微及超微结构有了一定的改善,治疗组生存期有明显延长.[结论]静脉移植同种、同系鼠骨髓干细胞的dko鼠,8周之后,部分骨骼肌细胞有缺失蛋白的表达、其微观病理变化有了一定改善,生存期得到延长;提示干细胞移植治疗DMD有效.     

骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗对Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx鼠病态肌肉的影响.方法 分离培养正常小鼠MSCs,局部肌肉注射移植入DMD型模型鼠mdx鼠肌肉,16周后观察mdx鼠肌肉肌力、肌肉病理学改变及dystrophin蛋白表达变化.结果 MSCs移植16周后mdx鼠肌纤维dystrophin蛋白表达增加,肌力好转,核中移明显改善.结论 MSCs移植可缓解mdx鼠肌肉病理改变,但移植效率的提高需要进一步研究.     

骨髓干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症转基因鼠的疗效

目的观察骨髓干细胞移植后肌萎缩侧索硬化症(ALS)模型鼠生存期和运动功能的变化。方法PCR法鉴定的6~9周龄ALS转基因阳性雌鼠(40只)分为ALS移植组(25只)和ALS对照组(15只),移植前5~7d给予5·5~6·5Gyγ射线预处理移植鼠;收取来自同窝正常雄鼠的全骨髓细胞,经尾静脉注射移植到移植鼠体内[(1~2)×107/只],ALS对照组尾静脉注射无血清培养基;评估移植物抗宿主病(GVHD)表现,移植8周后PCR法检测ALS移植鼠血基因组Y染色体的性别决定基因(Sry基因);与ALS对照组比较发病时间、生存期的改变,并以悬尾、转棒、转轮和牵引实验检测16~17周龄时两组ALS鼠的运动功能差别。结果部分移植鼠出现不同程度GVHD反应,GVHD总体评分1~2分,移植8周后检测移植鼠血基因组Sry基因结果呈阳性;ALS移植组比ALS对照组发病时间和生存期平均延后5周(P<0·01);16~17周龄时的悬尾、转棒、转轮和牵引实验检测结果显示移植组的运动功能比ALS对照组明显改善(P<0·01)。结论经静脉移植的正常小鼠骨髓干细胞能在ALS转基因阳性鼠体内长期存活,并可改善模型鼠的生存期、发病时间和运动功能,提示骨髓干细胞移植可能改善ALS预后的临床治疗前景。     

逆转录病毒介导的人抗肌萎缩蛋白小基因在mdx鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建含有人抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转移的假肥大型肌营养不良模型小鼠(mdx)骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法构建含有抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PA317,制备含有目的基因的重组逆转录病毒并感染mdx鼠的MSCs,利用免疫荧光、RT-PCR法检测目的基因的表达。结果成功构建了抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体。含抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒感染mdx鼠MSCs后48h,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现319bp DNA片断;免疫荧光检测显示感染组mdx鼠MSCs中可见红色颗粒,深浅不一。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将抗肌萎缩蛋白小基因转移至mdx鼠MSCs并表达。     

骨髓移植治疗DMD模型鼠后骨髓重建和目的蛋白的表达

目的：观察在骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠mdx鼠后．骨髓重建过程及目的蛋白的表达情况方法：对致死剂量放疗的20只mdx鼠进行BMT，于放疗后2、4、7、14、21、30d断尾取血，观察血液性状，用红细胞计数板计数红、白细胞数量，瑞-姬染色观察血涂片中血细胞变化情况，于移植后2个月用荧光免疫组化染色观察受体骨骼肌dystrophin的表达情况。结果：白细胞对放疗的反应最敏感、下降最快，红、白细胞在放疗1周内下降到最低点、血容量减少1周后白细胞和血容量逐渐增多，1个月左右恢复正常在移植后2个月部分mdx鼠肌膜上有dystrophin的表达结论：对外周血象的观察，可间接、敏感地反映放疗效果及骨髓造血情况，从而推断BMT成功与否BMT可使骨髓重建后病损骨骼肌上表达目的蛋白，利于骨骼肌修复。     

Duchenne肌营养不良模型鼠肌肉内移植小鼠胚胎干细胞后分化潜能的初步研究

目的 研究Duchenne肌营养不良模型鼠(mdx鼠)局部肌肉内鼠胚胎干细胞(ESCs)移植治疗后,ESCs的分化、肌肉病理改变及dystrophin蛋白表达变化.方法 eGFP标记的ESCs局部肌肉注射移植入mdx鼠,4周后观察核内移及dystrophin蛋白表达变化.结果 移植后4周mdx鼠核内移改善不明显,dystrophin蛋白阳性表达及肌纤维增加均不明显.结论 局部肌肉内胚胎干细胞移植治疗mdx鼠效果不明显.胚胎干细胞移植后分化为骨骼肌细胞的比例低.     

^3H-TdR标记人骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of using human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM- MSCs) for repairing the skeletal muscle sarcolemma lesions in mdx mice and characterize the distribution of the transplanted hBM-MSCs. METHODS: Eighteen 8- to 10-week-old immunosuppressed mdx mice received transplantation with 1x10(7) of hBM-MSCs (the fifth passage) with 3H-thymidine (3H-TdR) labeling by injection of the cells into the tail vein. The mice were killed at 24 h, 48 h, 2 weeks, and 1, 2 and 4 months after the transplantation, respectively, to measure the radioactivity in the tissues and organs. Dystrophin expression on the sarcolemma was detected by immunofluorescence analysis. RESULTS: One month after transplantation, the mice with cell transplantation showed greater radioactivity in most of the tissues and organs than the control mice, especially in the bone marrow, liver and spleen. The radioactivity was then gradually lowered but in the skeletal muscle, the radioactivity increased progressively since 2 weeks after transplantation, reaching the peak of 27.65+/-3.53 Bq/mg at 1 month. Compared with that in the control mice, the radioactivity in the bone marrow and skeletal muscle was persistently higher in mice with cell transplantation 1 month after transplantation. No dystrophin-positive cells were found in the mdx mice at 2 weeks but detected at 1 month. The percentage of dystrophin-positive fibers in each section ranged from a 6.6% (1 month) to 8.9% (4 months). CONCLUSIONS: hBM-MSCs engrafted in immunosuppressed mdx mice may differentiate into skeletal muscle cells to repair the pathological lesion of the skeletal muscle sarcolemma. The hBM-MSCs reside mainly in the bone marrow, liver and spleen in the early stage following transplantation, homing into the bone marrow and skeletal muscle later.     

3H-TdR标记人骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞移植mdx鼠能否修复骨骼肌肌膜病变及干细胞在其体内的分布特点.方法 用氚-脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)标记人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs),以每只鼠干细胞1×10⁷/0.3 ml经尾静脉注入18只免疫抑制的mdx鼠(8～10周龄).于移植后24 h、48 h、2周、1月、2月、4月处死鼠,分别测定各组织器官的放射活性;用免疫荧光法检测骨骼肌肌膜营养障碍基因(dystrophin,Dys)表达情况.结果 移植后1月,多数组织、器官放射活性显著高于对照组,其中以骨髓、肝、脾放射活性增高更为明显.大多数组织器官放射活性随时间推移逐渐下降,而骨骼肌放射活性的从2周时开始逐渐升高,于1月时达到高峰(27.6±3.3 Bq/mg湿重).1月之后,骨髓、骨骼肌放射活性仍保持较高水平.免疫荧光显示移植后24 h、48 h、2周骨骼肌Dys免疫荧光呈阴性,1月后呈阳性,1月、2月、4月阳性率分别为:6.6%、8.4%、8.9%.结论 hBM-MSCs能植入mdx鼠体内,并融合、分化为骨骼肌,部分修复骨骼肌肌膜病变;hBM-MSCs移植入mdx鼠后早期主要分布在骨髓、肝、脾,后期主要分布在骨髓、骨骼肌.     

骨髓间质干细胞移植治疗DMD模型鼠的肌组织dystrophin/utrophin表达

目的观察骨髓间质干细胞(MSC)移植治疗Duchenne肌营养不良症(DMD)动物模型dko小鼠后肌组织dystrophin/utrophin的表达情况.方法用体外培养纯化的第5代MSC经尾静脉移植治疗dko小鼠,移植后5、10、15、20周分别取实验鼠腓肠肌组织做荧光免疫组化检测dystrophin/utrophin的表达,计算阳性纤维的平均光密度.结果传3代以上呈集落生长的MSC均一性好,静脉移植免疫反应低.移植后5～20周dko小鼠肌膜组织dystrophin/utrophin免疫荧光表达强度有随着时间逐渐递增的趋势,移植15周前后肌膜荧光带光密度有显著性差异(P=0.035).结论MSC在体内外均具有强大的可塑性,通过血液循环MSC可趋向病变肌组织,并分化为表达dystrophin/utrophin的肌纤维,干细胞移植对dko小鼠肌萎缩组织有一定修复作用.     

骨髓干细胞移植改善dystrophin-/-/utrophin-/-鼠运动功能

目的 研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(dystrophin/utrophin gene double knock-outmice,dko鼠)的运动功能改善情况。方法 获取4～5周龄C57BL/6鼠的骨髓干细胞,体外培养3 d,以1.0×10~7/只静脉移植到经7Gy γ射线预处理的dko鼠(7～8周龄)。8～9周后,检测移植鼠运动功能、肌电图及肌肉组织dystrophin蛋白表达情况。结果 骨髓干细胞移植8～9周后,11只dko鼠牵引运动坠落次数为(3.09±2.47)次,与对照组(非移植组)dko鼠(16.78±3.6)次比较,有显著性差异;肌电图指标中,动作电位时限和最大收缩电位波幅分别为(4.99±1.62)ms,和(2872±1474.33)μV,与对照组(3.69±0.40)ms和(1210.00±551.00)μV比较,有显著改善;其肌肉组织有7％肌纤维表达了dystrophin蛋白。结论 静脉移植同种、同系鼠骨髓干细胞后,dko鼠的运动功能、电生理有了显著改善;其部分骨骼肌细胞有缺失蛋白的表达。提示干细胞移植治疗DMD有较理想的前景。     

建立Duchenne型肌营养不良鼠的骨髓移植模型

【目的】建立Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)的骨髓移植模型,摸索有效的放疗剂量。【方法】用体外培养的不同数量的C57BL/6雄鼠的骨髓细胞、骨髓基质细胞、骨髓悬浮细胞,用不同方法移植给不同剂量放疗后的mdx鼠,观察受体鼠的存活率及存活时间,并对死亡鼠作GVHD(移植物抗宿主病)的病理学检测。【结果】16只mdx鼠移植前3d12Gyγ射线照射,在移植后7d内全部死亡,且注射细胞数较多者,存活时间相对较长;8只经6Gyγ射线照射的mdx鼠,移植后60d,存活4只,其中1例经腹腔注射骨髓细胞、1例肌肉局部注射骨髓细胞,移植后7d内死亡;而8Gyγ射线照射的14只mdx鼠,移植后60d10例存活,4例死亡。【结论】本实验条件下,移植前8Gyγ射线放疗较合理,在有效剂量放疗破坏受体骨髓造血系统后,静脉注射移植同种鼠的骨髓细胞、基质细胞、悬浮细胞,mdx鼠存活率较高,且移植细胞数量以1×10