黄芩素通过抑制胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)促进HeLa细胞凋亡

目的探讨黄芩素和U0126对人宫颈癌He La细胞凋亡的影响及机制。方法 He La细胞先用(1、2、5、10、20、50、100、200、300)μmol/L黄芩素,(1、2、5、10、20、30)μmol/L U0126处理24 h后,CCK-8法筛选最佳的处理浓度。而后分别用200μmol/L黄芩素、10μmol/L U0126、200μmol/L黄芩素联合10μmol/L U0126处理He La细胞24 h,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡指数;实时定量PCR检测He La细胞胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、Bax和Bcl-2的mRNA水平、Western blot法检测ERK1/2、Bax和Bcl-2蛋白水平。结果 He La细胞经不同浓度的黄芩素或经不同浓度的U0126处理后,CCK-8法证明黄芩素最佳抑制浓度为200μmol/L,U0126最佳抑制浓度为10μmol/L;He La细胞经200μmol/L黄芩素处理24 h后,G0/G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显下降,采用200μmol/L黄芩素联合10μmol/L U0126处理He La细胞24 h,S期细胞比例显著降低;10μmol/L U0126和200μmol/L黄芩素单独处理He La细胞,引起明显细胞凋亡,二者联合处理凋亡更明显;He La细胞经200μmol/L黄芩素或10μmol/L U0126单独处理或联合处理24 h后,ERK1/2和Bcl-2的mRNA表达水平明显降低、而Bax的mRNA水平升高;蛋白水平上,ERK1/2的磷酸化水平明显降低,Bax蛋白水平增加,Bcl-2的蛋白水平降低。结论黄芩素和U0126均可抑制He La细胞增殖、诱导细胞凋亡,增加G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例,联合应用效果更明显。     

CPSIT_p7通过激活JNK/ERK信号通路诱导宿主细胞炎症

目的初步探讨鹦鹉热嗜衣原体蛋白CPSIT_p7对宿主细胞炎症反应的调节作用及其分子机制。方法佛波酯(PMA)处理THP-1细胞过夜,诱导其分化为贴壁的巨噬细胞,之后用CPSIT_p7蛋白刺激贴壁细胞,或先用30μmol/L ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB202190分别预处理贴壁细胞,再用CPSIT_p7蛋白处理贴壁细胞;Western blot检测ERK、JNK和p38磷酸化水平,ELISA检测各种炎症因子的表达水平。结果 0~10μg/ml CPSIT_p7蛋白刺激PMA诱导的THP-1细胞24 h后,随着CPSIT_p7质量浓度升高,IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α的含量呈剂量依赖性增加;10μg/ml的CPSIT_p7处理细胞0、6、12、24和36 h,在24 h时IL-6、IL-8及IL-1β表达水平达到高峰,而TNF-α在12 h就达到高峰;CPSIT_p7蛋白处理细胞后其ERK和JNK磷酸化水平显著升高,p38磷酸化水平改变不明显;JNK和ERK抑制剂能明显降低CPSIT_p7蛋白诱导的IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α表达。结论 CPSIT_p7通过JNK/MAPKs和ERK/MAPKs信号传导途径诱导THP-1产生IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α炎症因子,与p38/MAPKs信号传导通路无关。     

MAPKs在anti-β2GPI/β2GPI刺激THP-1细胞表达TF过程中的作用探讨

目的:探讨丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在anti-β2 GPI/β2 GPI复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的活化及其作用。方法:利用荧光定量PCR(Real-time PCR)、TF活性试剂盒等分别检测anti-β2 GPI/β2 GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF mRNA及TF活性,Western blot检测细胞表达p38、磷酸化-p38(p-p38)、ERK1/2、磷酸化-ERK1/2(p-ERK1/2)、JNK、磷酸化-JNK(p-JNK)的情况。进一步采用p38、ERK1/2、JNK抑制剂(SB203580、U0126、SP600125)观察是否能阻断anti-β2 GPI/β2 GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF。结果:Anti-β2 GPI/β2 GPI复合物(100μg/ml)能够显著增强THP-1细胞表达TF,并使p-p38、p-ERK1/2、p-JNK水平显著升高(P<0.05 vs control);其引发的MAPKs磷酸化具有时间效应性,均在刺激30分钟时达到高峰;对应的特异抑制剂SB203580(10μmol/L)、U0126(5μmol/L)、SP600125(90 nmol/L)单独或合并处理THP-1细胞后,anti-β2 GPI/β2 GPI复合物诱导细胞TF mRNA表达及TF活性的效应明显被阻断(P<0.01 vs control)。结论:Anti-β2 GPI/β2 GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,MAPKs被激活进而发挥重要作用。     

IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号通路调节研究

目的 研究IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号调节通路,探索DC -SIGN表达的信号调控网络.方法 以佛波脂(PMA)刺激THP-1细胞24h后加入IL-4作用48 h诱导DC-SIGN的表达,并设ERK阻断剂、NF-κB阻断剂、JAK-STAT阻断剂和MAPK阻断剂处理组.用RT-PCR检测DC-SIGN的mRNA表达,Western blot检测胞质内DC-SIGN蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面DC-SIGN的表达.另外,提取IL-4诱导0、10、20、30、60和120 min的THP-1细胞胞质和胞核蛋白,Western blot检测不同信号通路的信号蛋白及其磷酸化蛋白的变化.结果 IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,包括mRNA和胞膜蛋白水平.在mRNA、胞质和细胞表面蛋白表达3个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果最好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果.信号蛋白检测结果显示,IL-4诱导0～120 min内,胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65、NF-κBp50、磷酸化IKB和磷酸化AKT随时间推移浓度逐渐升高,而p38MAPK及其磷酸化蛋白浓度无明显改变.胞核内胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65和NF-κBp50随时间推移浓度逐渐升高.结论 ERK、JAK-STAT和NF-κB通路参与了DC-SIGN启动子的活化,其中以ERK通路为主.     

STAT6介导白细胞介素—13诱导巨核细胞系HEL细胞血小板膜糖蛋白Ⅱb和血管性血友病因子的表达

目的:探索信号转导子和转录激活因子6(STAT6)介导白细胞介素-13(IL-13)对巨核细胞系-人红白血病HEL细胞(HEL)血小板膜糖蛋白Ⅱ b(GPⅡ b)和血管性血友病因子(vWF)表达的作用,部分阐明IL-13的信号转导通路.方法:RT-PCR检测GPⅡ b和vWF mRNA的表达,免疫印迹法检测磷酸化的STAT6、 GPⅡ b和vWF蛋白的表达,图像分析检测电泳条带吸光度.结果:IL-13(100μg/L)作用HEL细胞,使HEL细胞STAT6磷酸化,磷酸化抑制剂A77-1726(50μmol/L)阻断了IL-13诱导的HEL细胞STAT6磷酸化.IL-13(100μg/L)上调了HEL细胞GPⅡ b和vWF mRNA和蛋白的表达,A77-1726(50μmol/L)抑制了STAT6介导的IL-13诱导HEL细胞GPⅡ b和vWF mRNA和蛋白的表达.结论:IL-13上调了HEL细胞GPⅡ b和vWF的表达,STAT6介导了IL-13上调HEL细胞GPⅡ b和vWF的表达.     

屋尘螨提取物激活气道上皮细胞EphA2-STAT3/p38 MAPK信号通路介导气道炎症

目的探讨受体酪氨酸激酶肝配蛋白A型受体2(EphA2)对屋尘螨提取物(HDM)诱导气道上皮细胞表达炎症细胞因子的作用及其机制。方法用EphA2小干扰RNA(siRNA)转染气道上皮细胞株16HBE细胞建立EphA2敲减的细胞模型,HDM刺激16HBE细胞后,采用实时定量PCR检测EphA2、白细胞介素6(IL-6)和IL-8 mRNA水平,细胞因子微球检测技术(CBA)检测IL-6、 IL-8、 IL-17A、 IL-17F和肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白水平;Western blot法检测EphA2、磷酸化的EphA2(p-EphA2)、信号转导子与转录激活子3(STAT3)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、 p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)、磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化的NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白水平。STAT3抑制剂Stattic联合HDM或p38 MAPK抑制剂SB203580联合HDM刺激16HBE细胞,实时定量PCR检测IL-6和IL-8 mRNA水平、 CBA检测IL-6和IL-8蛋白水平。结果敲低EphA2显著抑制HDM诱导16HBE细胞表达IL-6和IL-8,降低STAT3及p38 MAPK的总蛋白及磷酸化水平,但对NF-κB p65总蛋白及磷酸化水平均无明显影响。Stattic抑制STAT3表达及活化后,显著抑制HDM诱导16HBE细胞中IL-6和IL-8 mRNA和蛋白表达;而SB203580抑制p38 MAPK信号通路后,抑制HDM诱导16HBE细胞中IL-6和IL-8 mRNA表达水平,而对其蛋白水平无影响。结论 HDM通过激活EphA2-STAT3/p38 MAPK通路诱导16HBE细胞表达IL-6和IL-8参与气道炎症。     

ERK通路激动剂EGF及抑制剂U0126对HepG2肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)亚族细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路在HepG2肝癌细胞迁移和侵袭中的作用。方法体外培养人肝癌HepG2细胞,采用ERK通路激动剂和抑制剂:表皮生长因子(EGF)及U0126刺激48h,分别应用MTS法、划痕实验法及Transwell小室法检测EGF和U0126对HepG2细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响,qPCR和Western blot法分别检测ERK mRNA和磷酸化ERK蛋白的表达变化。结果细胞增殖、迁移和侵袭实验结果均显示,激动剂EGF可显著提高HepG2肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力(P0.01),而U0126均对以上指标有抑制效应(P0.05)。qPCR和Western blot结果显示,EGF可上调ERK mRNA和磷酸化蛋白的表达(P0.01),而U0126对ERK mRNA无明显影响(P0.05),但可显著下调ERK磷酸化蛋白的表达(P0.01)。结论 ERK通路参与HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭过程,EGF和U0126对以上指标的影响可能与ERK mRNA的表达及蛋白磷酸化过程相关。     

TWS119通过抑制STAT3磷酸化促进γδT细胞CCR5的表达

目的:研究糖原合酶激酶-3β抑制剂4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)促进γδT细胞趋化因子受体CCR5表达的分子机制。方法:用TWS119诱导从健康人外周血中分离培养获得γδT细胞48 h后,用流式细胞仪检测γδT细胞CCR5的表达;Western blot检测GAPDH和p-STAT3的表达。结果:培养10 d后的γδT细胞纯度达到85.79%±5.01%。TWS119浓度在0~8.0μmol/L范围内能显著促进趋化因子受体CCR5的表达,且剂量依赖性抑制STAT3的磷酸化。同时,用STAT3磷酸化抑制剂Stattic(0.5μmol/L)预处理γδT细胞也可以促进CCR5的表达,并能协同增强TWS119促进趋化因子受体CCR5的表达。结论:TWS119通过抑制STAT3磷酸化促进γδT细胞CCR5的表达。     

碱性成纤维细胞生长因子经ERK信号通路抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡

目的:研究卵巢癌CAOV3细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)经MEK/ERK1/2信号转导通路对CREB、Bcl-2表达以及对细胞凋亡的影响作用。方法:无血清饥饿诱导细胞凋亡。分为对照组、bFGF组、bFGF PD98059组。Annexin-EGFP/PI荧光双染法检测细胞凋亡。Western印迹法检测ERK1/2、CREB以及Bcl-2蛋白表达。RT-PCR法检测Bcl-2的mRNA表达。结果:bFGF可抑制无血清饥饿诱导的细胞凋亡;时效依赖性地诱导ERK1/2活性增高、刺激CREB磷酸化、促进Bcl-2的mRNA及蛋白表达增加。bFGF作用CAOV3细胞15 min时ERK1/2活性达高峰;45 min时CREB磷酸化达峰值;Bcl-2的mREN表达高峰为6h,8h时蛋白表达最高。MEK1抑制剂PD98059可抑制bFGF的上述作用。结论:bFGF可能通过激活MEK/ERK1/2/CREB/Bcl-2信号转导途径抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡。     

丙泊酚通过抑制 JNK / ERK1 / 2 通路抑制鼻咽癌 C666-1 细胞的增殖、 迁移和侵袭 #br#

目的 探讨丙泊酚对鼻咽癌 C666-1 细胞的作用及机制。 方法 C666-1 细胞分为 4 组: 对照组、丙泊酚 22、 33、 44 μmol / L 组。 CCK-8 实验、 流式细胞术、 Transwell 实验分别检测细胞活力、 凋亡、 侵袭和迁移能力; Western 印迹检测凋亡和侵袭相关蛋白表达。 JNK 抑制剂 SP600125 或 ERK1 / 2 抑制剂 U0126与丙泊酚 (44 μmol / L) 单独或联合处理细胞后, Western 印迹检测 JNK 和 ERK1 / 2 蛋白磷酸化, CCK-8 检测细胞活性。 构建裸鼠移植瘤, 免疫组化检测瘤组织中 p-JNK、 p-ERK1 / 2 和 Ki67 的表达, TUNEL 检测瘤 组织细胞凋亡。 结果 与 0 μmol / L 组比较, 丙泊酚 33 μmol / L 及以上浓度明显抑制 C666-1 细胞活力 ( P<0. 05)。 与对照组比较, 丙泊酚 33 和 44 μmol / L 组 C666-1 细胞中凋亡相关蛋白表达升高 ( P< 0. 05), 细胞凋亡数增加 (P< 0. 05); 细胞侵袭和迁移数减少 (P< 0. 05), 侵袭相关蛋白及 JNK 和 ERK1 / 2 磷酸化水平显著降低 (P< 0. 05), SP600125 或 U0126 与丙泊酚单独或联合组均降低细胞存活率 ( P< 0. 05)。 丙泊酚显著抑制移植瘤生长并促进凋亡 (P< 0. 05)。 结论 丙泊酚通过抑制 JNK / ERK1 / 2 通路诱导鼻咽癌 C666-1 细 胞凋亡, 抑制增殖、 侵袭和移植瘤生长。     

IL-8通过上调Bcl-2的表达和下调caspase-3的表达抑制MCF-7乳腺癌细胞凋亡

目的探讨白细胞介素8(IL-8)对乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响及其机制。方法 Western blot法检测MCF-7细胞IL-8受体CXC趋化因子受体1(CXCR1)、CXCR2的表达;反转录PCR、Western blot法检测(0、20、40、80、160)ng/mL IL-8对MCF-7细胞Bcl-2、caspase-3表达的影响;CCK-8法检测(0、40、80)ng/mL IL-8对MCF-7细胞增殖的影响;相差显微镜下观察80ng/mL IL-8处理MCF-7后细胞形态的变化;Western blot法检测80ng/mL IL-8联合信号通路抑制剂10μmol/L PD980590、10μmol/L LY294002或50μmol/L AG490[分别为丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)、磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号通路抑制剂],共同处理MCF-7细胞后,细胞内Bcl-2蛋白表达的变化;Western blot法检测(0、20、40、80、160)ng/mL IL-8对MCF-7细胞磷酸化p-AKT表达的影响;流式细胞术、反转录PCR以及Western blot法分别检测80ng/mL IL-8联合10μmol/L LY294002共同处理MCF-7细胞后,细胞凋亡以及细胞内Bcl-2、caspase-3表达的变化。结果 IL-8受体CXCR1、CXCR2在MCF-7细胞中均有表达;在IL-8的作用下,MCF-7细胞Bcl-2表达升高,caspase-3表达下降,抗凋亡能力明显增强;IL-8能显著上调MCF-7细胞中p-AKT的表达;PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002能显著抑制IL-8抗MCF-7细胞凋亡的作用,且减少Bcl-2并增加caspase-3的表达。结论 IL-8可显著抑制MCF-7细胞的凋亡,其机制可能与IL-8激活PI3K/AKT信号通路而上调Bcl-2、下调caspase-3的表达有关。     

TNF刺激肥大细胞IL-6分泌的信号转导通路

目的:检测TNF对肥大细胞IL-6、IL-10分泌和组胺释放的影响并探讨其可能的信号转导途径。方法:用不同浓度TNF激发肥大细胞系P815后收集细胞和上清,细胞用细胞激发信号ELISA(CASE)方法检测信号转导通路蛋白ERK、p38、和STAT3磷酸化水平,上清用ELISA检测组胺、IL-6和IL-10的水平。结果:ELISA结果显示TNF促进P815肥大细胞IL-6分泌(P<0.05),但对IL-10分泌和组胺释放无明显影响。ERK信号转导通路抑制剂PD98059和U0126抑制TNF引起的P815肥大细胞IL-6分泌(P<0.05),而p38信号转导通路抑制剂SB203580和STAT3信号转导通路抑制剂AG490不能抑制TNF引起的P815肥大细胞IL-6分泌。CASE结果显示ERK信号转导通路抑制剂PD98059,U0126抑制TNF引起的P815肥大细胞内ERK蛋白磷酸化(P<0.05)而p38信号转导通路抑制剂SB203580和STAT3信号转导通路抑制剂AG490不能抑制TNF引起的P815肥大细胞内p38和STAT3蛋白磷酸化。结论:TNF刺激小鼠肥大细胞P815分泌IL-6可能与ERK信号转导通路的激活有关的。     

ERK1／2-STAT3通路在H2O2预处理导致的适应性细胞保护中的作用

目的:探讨ERKI/2一STAT3通路在H2O2预处理导致的适应性细胞保护中的作用.方法:在PCI2细胞建立H2O2预处理对抗氧化应激(300 pmot/L H202)损伤细胞的模型.应用Hoechst33258核染色法观察细胞调亡的形态学改变;应用碘化丙啶(P1)染色流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫印记法(Western blotting)测定P-ERKI／2和P-STAT3的表达水平.结果:100μmol/L H2O2预处理PCI2细胞90 rain可明显抑制300μmol/LH2O2作用12 h引起的细胞凋亡,并激活ERKl/2和STAT3;ERKI/2抑制剂U0126和JAK2抑制剂AG一490(10μmol/L)均可明显地阻断H2O2预处理引起的细胞保护作用;U0126(10μmol/L)亦能明显地抑制H2O2预处理对STAT3的上调作用.结论:H202预处理能激活PCI2细胞的ERKl/2-STAT3信号转导旁路,这可能是预处理的细胞保护机制之一.     

红景天苷通过细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路诱导树突状细胞抗肿瘤作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路在红景天苷(SAL)调控树突状细胞(DC)抗肿瘤的作用。方法建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,分别体内给予生理盐水(0.2 mL/d)、 SAL[500 mg/(kg·d)]和环磷酰胺(CTX)[10 mg/(kg·d)]治疗。检测Lewis肺癌荷瘤小鼠的生存期和肿瘤质量。同时,体外分离Lewis肺癌荷瘤小鼠骨髓来源的DC诱导培养。经磁珠分选后,分别与PBS、 0.05 mg/mL SAL、 200 ng/mL脂多糖(LPS)或0.05 mg/mL SAL联合ERK抑制剂U0126共培养48 h,流式细胞术检测磷酸化的ERK(p-ERK)水平。另外,将DC分别与PBS、 0.05 mg/mL SAL或200 ng/mL LPS共培养48 h,流式细胞术检测磷酸化的p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)和磷酸化的JNK(p-JNK)表达量。此外,收取磁珠分选后DC与PBS、 0.05 mg/mL SAL、 200 ng/mL LPS或0.05 mg/mL SAL联合ERK抑制剂U0126共培养后的细胞上清, ELISA检测DC分泌IL-12p70的能力。最后,将Lewis肺癌荷瘤小鼠骨髓来源的致敏DC经SAL刺激后与尼龙毛柱吸附纯化的C57BL/6正常小鼠脾T淋巴细胞共培养作为效应细胞,再按照10∶1、 25∶1、 50∶1效靶比加入3LL靶细胞, CCK-8法检测体外细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果 SAL可以显著抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长并提高其生存期;与PBS处理的DC相比, SAL组DC中ERK磷酸化水平显著升高,使用ERK抑制剂U0126后,磷酸化ERK的表达量显著降低; SAL对p38MAPK通路和JNK通路的磷酸化无明显影响; SAL组DC的IL-12p70分泌水平显著升高,使用ERK阻断剂U0126后DC分泌IL-12p70水平显著上升; SAL增强CTL的杀伤能力。结论 SAL抑制Lewis肺癌荷瘤的肿瘤生长,激活ERK信号通路,促进DC分泌IL-12p70并增强CTL杀伤能力。     

沙眼衣原体质粒蛋白Pgp3经NOD1/RIP2信号通路诱导HeLa细胞产生IL-8

目的探讨沙眼衣原体质粒蛋白Pgp3诱导HeLa细胞产生IL-8的机制。方法选择不同质量浓度的Pgp3蛋白刺激HeLa细胞并在不同时间点收集细胞,Real-time PCR检测Pgp3刺激HeLa细胞后IL-8转录水平,Western blot和Real-time PCR分别检测NOD1的表达水平及下游蛋白RIP2的转录水平;Western blot检测ERK1/2和p38磷酸化水平;HeLa细胞用NOD1抑制剂ML130、RIP2抑制剂GSK583、ERK抑制剂PD98059和p38抑制剂LY2228820分别预处理后,再用Pgp3蛋白刺激细胞,ELISA和Real-time PCR检测IL-8的表达水平。结果 0~24μg/ml的Pgp3蛋白刺激HeLa细胞后,IL-8的含量呈时间和质量浓度依赖性,Pgp3蛋白刺激HeLa细胞能调控NOD1及RIP2的表达,同时ERK1/2和p38磷酸化水平显著升高;NOD1和RIP2抑制剂并不影响Pgp3蛋白诱导的ERK和p38磷酸化水平;用4种抑制剂预处理HeLa细胞后,Pgp3刺激HeLa细胞,IL-8表达量均出现下降。结论 Pgp3经NOD1/RIP2以及活化ERK1/2和p38信号通路诱导HeLa细胞调控IL-8的产生。     

黄芩素和U0126体外抗人乳腺癌的作用及机制研究

目的:探讨黄芩素和U0126体外对乳腺癌的作用及其机制。方法:用黄芩素、U0126单独处理以及二者联合处理人乳腺癌细胞株MCF-7细胞,采用CCK8检测细胞增殖变化;流式细胞术检测MCF-7细胞周期以及凋亡变化;显微镜观察细胞数量变化;TUNEL法检测细胞凋亡改变;划痕实验分析细胞迁移情况;Western blot实验检测细胞凋亡相关因子的蛋白水平变化,分析黄芩素与U0126对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。结果:黄芩素或U0126可抑制细胞的增殖且具有浓度依赖性(P0.05);黄芩素阻滞MCF-7细胞周期进入S期,增加G0~G1期细胞比例(P0.05),降低S期细胞比例(P0.05),诱导细胞凋亡(P0.05);降低ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平和CyclinD 1的蛋白水平表达;黄芩素与U0126联合处理MCF-7细胞,与黄芩素单独处理组相比较,S期细胞比例明显降低(P0.05),细胞凋亡更加明显(P0.05),ERK1/2和JNK的磷酸化水平(P0.05)、CyclinD 1的蛋白表达量降低更加明显(P0.05);同时黄芩素可有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移(P0.05)。结论:黄芩素和U0126通过降低ERK1/2、JNK的磷酸化水平表达,降低CyclinD 1的水平表达,有效抑制MCF-7细胞增殖和迁移,诱导MCF-7细胞凋亡并且二者具有协同作用。因此,黄芩素和U0126联合有望用于临床治疗乳腺癌。     

血管紧张素(1-7)通过抑制JAK/STAT信号通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

目的:研究血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过抑制JAK/STAT信号通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤。方法:CCK-8检测细胞存活率;Western blot法检测内皮细胞JAK2、STAT3、pJAK2、p-STAT3、cleaved caspase-3和内皮型一氧化氮合酶(e NOS)的蛋白水平;Hoechst 33258染色荧光显微镜照相法检测内皮细胞凋亡数量;DCFH-DA染色荧光显微镜照相法检测内皮细胞内活性氧簇(ROS)的水平。结果:应用高糖(40 mmol/L)处理HUVECs 12~48 h能明显上调JAK2的磷酸化水平,于24 h达最高峰;在24~48 h能明显上调STAT3的磷酸化水平,于36 h最高;在12~24 h能明显上调cleaved caspase-3的表达,在3~48 h随着时间延长,e NOS的表达逐渐降低。2μmol/L的Ang-(1-7)或20μmol/L的JAK/STAT通路抑制剂AG490预处理0.5 h可显著抑制由高糖引起的内皮细胞损伤,表现为p-STAT3、p-JAK2及cleaved caspase-3蛋白水平降低、细胞存活率及e NOS表达升高,细胞凋亡数量和胞内ROS生成减少。结论:Ang-(1-7)能通过抑制JAK/STAT通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。     

熊果酸减轻LPS诱导的THP-1细胞损伤

目的探讨熊果酸减轻脂多糖诱导的THP-1细胞损伤的作用及其机制。方法以脂多糖诱导的THP-1炎性细胞为模型,MTT法检测不同浓度的熊果酸(0.1、1、5、10、20、40和80μmol/L)对细胞增殖的影响,RT-PCR法检测TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测MCP-1和IL-6表达,Western blot法检测P65、磷酸化P65蛋白表达,荧光素酶报告系统检测核转录因子κB(NF-κB)活性。结果与对照组比较,LPS作用组能显著增高MCP-1、TLR4、IL-6 mRNA和MCP-1、IL-6、P65、磷酸化P65蛋白的表达并上调NF-κB活性(P0.05);与LPS单独作用组比较,熊果酸(1和5μmol/L)干预组能够显著降低MCP-1、TLR4、IL-6mRNA和MCP-1、IL-6表达水平并下调NF-κB活性(P0.05)。结论熊果酸可能是通过下调NF-κB活化减轻脂多糖诱导的THP-1细胞的损伤。     

黄芩素和U0126 体外协同抗人膀胱癌细胞的作用及机制研究

目的：探讨黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌T-24细胞的作用及机制研究。方法：用黄芩素、U0126及二者联合处理T-24细胞,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡;显微镜下计数细胞数量变化;TUNEL法检测细胞凋亡指数;实时定量PCR和Western blot分别检测T-24 细胞胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 、CyclinD1、GSK-3β和AKT ＲNA水平、蛋白水平,分析黄芩素与U0126对膀胱癌细胞凋亡和增殖的影响。结果：T-24细胞经不同浓度黄芩素处理后, 细胞凋亡率显著增加;T-24细胞经黄芩素处理24 h,G0/G1 期细胞比例明显增多,S 期细胞比例明显下降,细胞数减少,采用黄芩素联合U0126 处理T-24细胞24 h,S 期细胞比例显著降低;黄芩素或U0126单独处理T-24细胞引起明显细胞凋亡,二者联合处理凋亡更明显;利用两种药物单独或联合作用T-24细胞24 h,GSK-3β、ERK1/2、AKT磷酸化水平显著降低, ERK1/2、CyclinD1的 mRNA表达减少,联合处理作用更显著。结论：黄芩素和U0126 均可诱导T-24细胞凋亡,增加G0/G1 期细胞比例,降低S 期细胞比例,联合应用效果更明显。     

GCS通过MEK/ERK通路调控白血病多药耐药细胞凋亡相关基因bcl-2的表达

目的:探讨葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)是否通过MEK/ERK信号通路调控凋亡相关基因bcl-2的表达,从而诱导人白血病K562/A02细胞多药耐药。方法:用小干扰RNA(siRNA)靶向干扰K562/A02细胞中GCS的表达,real-time PCR、Western blotting检测Bcl-2、磷酸化及总ERK水平;用MEK特异性化学抑制剂U0126抑制MEK/ERK信号通路的活化,real-time PCR与Western blotting技术分别检测Bcl-2 mRNA与蛋白水平;CCK-8试剂盒检测细胞存活情况。结果:与阴性对照组比较,GCS siRNA明显抑制K562/A02细胞GCS和Bcl-2的表达,并抑制MEK/ERK信号通路的活化;U0126使Bcl-2 mRNA及蛋白水平呈浓度依赖性下降,并使K562/A02细胞ADM敏感性增加。结论:GCS通过MEK/ERK信号通路调控K562/A02细胞株中凋亡相关基因bcl-2的表达,从而诱导白血病细胞多药耐药。