基于COI 条形码的鹿类中药材DNA 条形码分子鉴定

目的：利用COI 序列建立统一的鹿类药材分子鉴定方法。方法：对鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分别进行DNA 提取、COI 序列扩增和序列测定,构建鹿类药材COI 序列数据库,并对市售鹿类药材进行调查分析。结果：所有鹿类药材均可以使用COI 通用引物进行PCR 扩增和测序;鹿类药材COI 序列数据库包含8 个物种101 份样品,物种之间相互区分明显;市售40 份药材中18 种为药典规定物种,22种为非药典规定物种。结论：COI 序列的DNA 条形码分子鉴定方法可以作为鹿类药材的统一鉴定方法,并为市售鹿类药材的鉴定提供科学依据。     

角类动物药DNA提取方法研究

目的建立角类动物药材的DNA提取方法,使提取的DNA质量满足PCR及测序要求,同时可用于陈旧动物角类样品的DNA提取。方法为避免取骨塞部位用EDTA脱钙造成DNA提取不完全或DNA被破坏,取角质层部位,采用二硫苏糖醇(DTT)结合化学试剂盒中的细胞裂解液及蛋白酶K处理角质层样本,其余按试剂盒操作提取DNA。考察了取样量、DTT用量对角质部位DNA质量的影响。结果确定了取样量为25 mg,DTT用量为20μL,角质细胞裂解完全,所有样品的DNA质量均可满足PCR要求。结论建立的DNA提取方法,提取DNA完全,可标准化操作,可应用于多种动物角的提取。     

鹿骨类药材DNA提取方法研究

目的:建立一种简便、实用、高效的鹿骨DNA提取方法,为动物骨类药材真伪鉴别奠定基础.方法:取净制后的梅花鹿骨、马鹿骨、牛骨、狗骨、猪骨样品,经干燥、研磨粉碎后,对脱钙时间(24,48,72h),脱钙温度(4,25,37,56,70℃)及不同提取方法(改良SDS提取法、试剂盒提取法)进行考察,分析比较不同提取方法获得的DNA质量.结果:实验证明,脱钙过程有助于骨细胞的裂解,在较宽泛的脱钙时间及脱钙温度下,均可从骨细胞中获得DNA,但提取量稍有差异.结论:骨粉经0.5mol·L(-1)EDTA脱钙液4℃脱钙24h,加入裂解液后56℃水浴1h,即可从鹿骨(约0.1g)中提取到高质量DNA,用于PCR扩增.     

中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的：建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法: 以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果：改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论：通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。     

半夏药材炮制品DNA提取方法的优化及分子鉴定

目的:优化炮制半夏基因组DNA提取方法并进行市售炮制药材的分子鉴定。方法:以半夏药材炮制品为试验材料,对CTAB水浴后沉淀试剂进行筛选,并优化样品用量、沉淀试剂和裂解时间3个参数,建立半夏炮制品DNA提取方法;采用该法提取市售13份姜半夏和法半夏基因组DNA,用基于ITS2序列的PCR扩增法进行分子鉴定。结果:以CTAB水浴后加入甲醇处理可有效促进DNA沉淀,起始半夏药材0.5 g、水浴裂解时间1 h即可快速高效获得基因组DNA。对所提取DNA样品进行PCR扩增,所有样品全部成功测序。相似性搜索法分析表明,13份样品中10份为掌叶半夏,3份为半夏。结论:该研究建立了简易快速的半夏药材炮制品DNA提取技术,所提DNA满足半夏药材的分子鉴定要求。该结果也提示市售半夏药材混伪情况较多,值得重视。     

市售鹿茸饮片及鹿茸粉的DNA条形码鉴定

目的利用COI序列对市售鹿茸饮片、鹿茸粉进行鉴定,并建立统一的分子鉴定方法。方法对不同产地的鹿茸饮片及鹿茸粉分别进行DNA提取、COI序列扩增和序列测定,建立分子鉴定方法,并对市售鹿茸饮片、鹿茸粉进行调查分析。结果鹿茸饮片均可以使用COI通用引物进行PCR扩增和测序;物种之间相互区分明显;市售40份药材中14份为药典规定物种,26份为非药典规定物种;鹿茸粉未成功获得COI序列。结论COI序列的DNA条形码鉴定方法可准确、有效鉴定市售鹿茸饮片,此方法为市场监管鹿茸饮片提供科学手段。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

应用DNA条形码ITS2序列对市售药材黄柏的鉴定研究

目的：应用DNA条形码ITS2序列鉴定市售黄柏药材及其混伪品,保障药材质量及用药安全。方法：对90份药材及其基原植物样品进行DNA提取,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增ITS2序列并进行双向测序,运用CodonCode Aligner V3.7.1对测序峰图进行校对拼接,去除低质量区和引物区,得到ITS2序列,运用MEGA 6.1对序列进行比对分析,基于K2P遗传距离构建系统聚类树。结果：90份实验样品均能提取到DNA,其DNA经PCR扩增、测序,序列拼接剪切后均能得到高质量ITS2序列。川黄柏和关黄柏基原物种黄皮树和黄檗的种内最大K2P遗传距离分别为0.018和0.004,均远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离（0.051和0.056）;NJ树结果显示川黄柏和关黄柏聚为一支,其混伪品各自聚为一支。结论：基于ITS2序列的DNA条形码技术可准确、有效地鉴定市售黄柏药材及其混伪品,为其市场监管及用药安全提供了一种高效的技术方法。     

碱裂解法快速提取中药炒制品DNA的研究

该文旨在探索一种适用于中药炒制品DNA快速提取的方法。以氢氧化钠,1%PVP40和1%Triton X-100配制成碱裂解缓冲液,Tris-HCl为中和液,经加热裂解和中和2步提取不同炒制方法制备的中药炮制品的DNA,选择2种方法对DNA进行纯化,并以纯化后DNA作为模板利用通用引物进行PCR扩增。结果表明优化碱裂解法可简单快速的提取出药材DNA,槐米炒制品DNA质量浓度为(420.61±123.91)g·L-1,且使用5%Chelex-100树脂纯化可以提高DNA提取浓度。研究结果证明优化碱裂解法适用于中药炒制品的DNA快速提取。     

沉香DNA提取方法及种质资源聚类分析研究

目的：分别建立适用于提取不同类型沉香样品（叶片、干燥枝条、药材）DNA的方法,通过ITS2序列对沉香药材进行种质资源聚类分析。方法：根据沉香叶片、干燥枝条、药材的组织差异,分别采用试剂盒法和优化的CTAB法提取DNA;利用紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及ITS2序列测定来检测DNA的纯度、浓度及可用性,以比较不同DNA提取方法的效率;将样品测序结果与从GenBank下载的沉香属（Aquilaria spp.）、拟沉香属（Gyrinops spp.）,及沉香药材常见混伪品的ITS2序列,进行聚类分析。结果：优化的CTAB法提取得到的DNA纯度比试剂盒法稍低,但浓度更高。两种方法所提沉香总DNA进行ITS2序列的PCR扩增成功率和测序成功率均为100%。ITS2序列能准确鉴别出4个沉香混伪品和2个拟沉香物种,且15个沉香样品ITS2序列与Aquilaria subintegra（泰国）、Aquilaria sinensis（中国）、Aquilaria crassna（柬埔寨、泰国）三个沉香物种均100%相似。结论：本研究中的两种DNA提取方法均可用于沉香DNA条形码研究;优化CTAB法比试剂盒法更适用于药材DNA的提取,该方法为有关中药材DNA的提取提供了参考;ITS2序列可为沉香种质资源的鉴定和系统发育分析提供必要的实验依据。     

滤纸法快速提取中药材DNA方法的研究

目的:为了建立一种快速提取中药材DNA的新方法,本研究考察了滤纸法对中药材DNA提取的适用性。方法:提取了33个中药材DNA,动物药使用COI(除了海马)、植物药使用ITS2、真菌使用ITS通用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。结果:通过琼脂糖凝胶电泳检测发现,27个中药材PCR扩增成功,扩增成功率达到81.8%。结论:研究结果表明滤纸法对于动物类、叶类、花类、全草类、果实类及根茎类药材DNA提取有较好的效果,提取时间可控制在30 s之内。滤纸法缩短了DNA提取时间,减少了提取成本,将在中药材分子鉴别中发挥重要作用。     

阿胶DNA提取方法优化

目的:优选阿胶DNA的提取方法和效率,为其他高蛋白含量产品中DNA的提取提供参考。方法:采用十二烷基苯磺酸钠(SDS)法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取阿胶DNA,针对阿胶产品的自身特性,优选SDS法中蛋白酶K作用时间和蛋白洗脱步骤。结果:在同等条件下,SDS法较CTAB法对阿胶DNA的平均提取量高0.022 g·L-1。优化的SDS法为蛋白酶K作用时间1.5 h,使用酚-三氯甲烷-异戊醇洗脱阿胶中蛋白质,重复3次;阿胶DNA的纯度较原工艺提高了48.3%。结论:采用SDS法对阿胶中蛋白的清除作用较CTAB法效率高,优化的SDS法对阿胶DNA的提取适用性较强,为阿胶中动物来源分子生物学检测提供条件。     

中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

葛根素对PMA诱发心肌细胞肥大的影响

 目的 利用体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞,探讨葛根素(puerarin,Pue对PKC通路的激动剂(佛波醇酯,PMA所致心肌细胞肥大的抑制作用和与蛋白激酶C(PKC,c-fos之间的关系。方法 新生大鼠心肌细胞培养,除对照组外,分别给予PMA(均为10-7mol·L-1、PMA+Pue（其中Pue按浓度分为10-8mol·L-1,10-7mol·L-1,10-6mol·L-1、PMA+10-5mol·L-1白屈菜季氨碱(chelerythrine,Che,观察Pue对培养心肌细胞体积、总蛋白质含量、3H-亮氨酸的掺入、PKC活性及c-fos的影响。结果 PMA组的上述指标与对照组相比显示心肌肥厚模型制备成功(P<0.01;Pue可显著减少肥大心肌细胞的蛋白质含量、心肌细胞体积、3H-亮氨酸的掺入、PKC活性及c-fos的表达,且与che无明显差异。结论 Pue抑制心肌肥大可能与PKC和c-fos有关。     

反相高效液相色谱法同时测定人血浆中亚叶酸、5-甲基四氢叶酸及甲氨蝶呤的浓度及临床应用

 目的 建立一种同时测定人血浆中亚叶酸、5-甲基四氢叶酸及甲氨蝶呤（MTX）浓度的反相高效液相色谱法。方法 乙腈沉淀后,上清液用氮气吹干,残留物流动相复溶后进样。色谱条件：分析柱为Spherisob C₁₈反相柱,流动相为0.05 mol·L-1醋酸钠 + 0.07 mmol·L-1 EDTA缓冲液（pH 4.4）：甲醇梯度洗脱,流速：1.0 mL·min-1,紫外及荧光同时检测。结果 亚叶酸、5-甲基四氢叶酸及MTX的保留时间分别为11.6,16.0,27.0 min; 检测限分别为0.5,0.05,0.05 mg·L-1;线性关系良好,r分别为0.998 0、0.999 2、0.998 9 (n=6);低、中、高浓度的回收率、日内及日间精密度均符合方法学要求。结论 本方法结果稳定,重现性好,可以用于临床大剂量MTX化疗体内药物浓度监测。     

中成药DNA提取技术优化及其在人参类制剂分子鉴定中的应用

目的 建立并完善从中成药及保健品中提取DNA的有效方法,并在人参类制剂中进行验证。方法 使用中成药和保健品中常用的辅料(如淀粉、蔗糖、葡萄糖等)模拟CTAB法提取DNA过程,用以筛选影响提取DNA效率的因素;使用甲醇作为沉淀试剂优化传统的CTAB法,并使用MAS-PCR方法对市场上人参类中成药及保健品进行分子鉴定,以验证优化的技术。结果 中成药及保健品中的淀粉(包括药源性淀粉和辅料添加的淀粉)通过CTAB反应后生成极性较大的复合物,其与70%乙醇不能互溶,而且在碱性条件下对DNA有强烈的溶解作用,从而影响了CTAB法提取DNA的提取效率;利用甲醇作为沉淀试剂能够有效去除CTAB裂解过程中产生的高极性复合物的影响,70%甲醇-醋酸钠溶液能够有效提取中成药及保健品的DNA;利用优化的DNA提取方法和MAS-PCR法实现了11种市售人参类制剂的快速分子鉴定,结果显示8种与商品描述一致、1种有掺伪情况、2种为伪品。结论 使用甲醇作为沉淀试剂优化传统的CTAB法,可以较好地克服中药制剂中淀粉对DNA提取的不利影响,可以有效地实现基于DNA的中药制剂分子鉴定。     

6种决明属药用植物种子毛细管电泳法鉴别

目的 :利用毛细管电泳鉴别六种豆科决明属药用植物种子。方法 :采用高效毛细管电泳对六种决明属植物种子中的水溶性成分进行分析 ,电泳分离缓冲液为 0.1mol·L^-1SDS ,0.1mol·L^-1硼酸盐 (pH =8.5) ,运行电压为 25kV。结果 :确定 4个峰为 6种决明属植物种子的共有峰 ,并得到各自的特征峰。结论 :6种决明属植物种子的毛细管电泳指纹图谱有明显的差异 ,可利用这些差异对其进行鉴别。