毕赤酵母系统来源的重组人血清白蛋白的制备及初步晶体学分析

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),为血浆中含量最丰富的蛋白质,具有调控血液中的功能蛋白质、脂肪酸、激素、药物和维持血液渗透压功能。毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GSll5/p PIC9K-rHSA经50L发酵罐发酵,发酵液冷冻离心,上清液超滤浓缩后,依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和SP Sepharose 6FF离子层析纯化,实现rHSA的规模化制备,最终rHSA的纯度可达99.9%以上。通过rHSA的结晶条件筛选实验,筛选出沉淀剂分别为PEG 1500、PEG 3350、PEG 6000、MPEG 2000和MPEG 5000五种结晶条件,结晶环境均为疏水性环境,并且结晶环境不能含有类似DTT的强还原剂。其中沉淀剂为MPEG2000条件下优化出的rHSA和pHSA蛋白晶体经X光衍射分辨率最好,分别为3.4魡和3.1魡,通过分子置换法得到rHSA和pHSA的晶体结构,二者结构大体相似,为rHSA在临床上的应用和HSA融合蛋白的晶体结构研究提供可靠的依据和基础。     

蛋白A的固定及在抗体亲和纯化中的应用

目的 以蛋白A作配基偶联活化的Sepharose 4FF后纯化兔免疫蛋白IgG.方法 以环氧氯丙烷(ECH)活化凝胶,正交试验确定最佳活化条件;以纯化数据确定抗体兔免疫蛋白IgG纯化最佳缓冲液盐浓度.结果 Sepharose 4FF最佳活化条件:ECH浓度20％(v/v),0.8 mol/L NaOH添加量为1 mL/1 g Sepharose 4FF湿胶,活化时间2.5 h,反应温度40℃.结论 建立将活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF与蛋白A偶联的条件,可应用于纯化兔免疫蛋白IgG.     

人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定

采用课题组已构建的携带人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白(rhIL-2-HSA)基因的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115进行rhIL-2-HSA的分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩、Blue Sepharose亲和层析、Octyl Sepharose疏水层析和DEAE Sepharose离子交换层析纯化获得较高纯度的目的产物,SDS-PAGE检测为单一条带。Western Blot分析结果显示,目的产物同时具有HSA和IL-2的抗原性,为HSA和IL-2的融合分子。经CTLL-2/MTT细胞增殖法测定,纯化的融合蛋白的生物学活性为1.147×107 IU/mg。     

抗肿瘤19肽在大肠杆菌中的融合表达与纯化

将重组载体pet32a-19肽转化到表达宿主菌大肠杆菌中,对其进行摇瓶发酵实验来优化重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件。通过Ni Sepharose 6 Fast Flow对重组蛋白进行纯化,用梯度透析的方法进行复性。结果表明:筛选出了pET32a-19肽-BL21(DE3)高效表达菌株,在发酵条件为培养基的pH7.0、接种量3%、IPTG浓度0.1mmol/L、IPTG添加时间OD600为0.7、诱导温度41℃和诱导时间5h时蛋白表达量最高,为54.57mg/L,得到纯度为95%以上的融合抗肿瘤19肽,并成功复性出融合蛋白。     

工业生产中耐高温α-淀粉酶发酵培养基的优化研究

通过对一株高产耐高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌摇瓶发酵工艺的优化,以及在摇瓶和20 L发酵罐上进行的耐高温α-淀粉酶液态发酵工艺条件的试验研究,确定发酵培养基所采用的最佳氮源为豆饼水解液,最佳碳源为玉米粉液化液.正交试验结果表明:优化摇瓶发酵培养基配方为玉米液化液12.5%,豆饼粉5%,豆饼水解液2.5%,(NH4)2SO40.5%,摇瓶产酶活可达5 000 U/mL,比优化前提高了10%,20 L发酵罐产酶活达到了12 000 U/mL.     

抗克百威单链抗体的可溶性表达、纯化与鉴定

在前期获得了抗克百威单链抗体基因的基础上,为进一步研究克百威单链抗体的性质,本文构建了两种抗克百威单链抗体可溶表达载体,p ET22b(+)-C-6His-CBF-sc Fv和p ET22b(+)-N-6His-CBF-sc Fv。比较His标签处于不同位置时,目的蛋白与Ni结合作用,发现His标签处于N端的目的蛋白与Ni结合作用比His标签处于C端时要强。对影响N-6His-CBF-sc Fv可溶性表达的条件进行优化,进而对其进行纯化。结果表明,当选用LB培养基,表达温度18℃,表达时间为16 h,IPTG浓度为1 mmol/L时可溶表达效果最好,可溶表达的目的蛋白量占总目的蛋白量从优化前的10%增加到50%。优化表达后的N-6His-CBF-sc Fv破壁上清经Ni Sepharose HP金属螯合亲和层析及阳离子交换层析两步纯化,纯化后纯度达90%。经ic ELISA鉴定,抗克百威单链抗体保持抗原结合活性,IC_(50)值为63.80 ng/m L。获得的抗克百威单链抗体可用于后续特性研究。     

PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功. PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDSPAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31 000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。     

离子交换法纯化罗非鱼血超氧化物歧化酶的研究

为使罗非鱼血超氧化物歧化酶(SOD)的纯化工艺条件更加合理、简便和高效,对离子交换法(IEX)纯化SOD的相关条件进行了探索和优化.最后确定的最佳工艺条件为:离子交换流动相为pH8.020mmol/L的Tris-HC1缓冲液,分步洗脱的条件为10％B液20min→30％B液15min→l00％B液15min,最佳上样量为4mL,最大流速为150cm/h.离子交换后所得酶样比活力为4052U/mg蛋白,回收率为59.7％,纯度提高942倍优化后的纯化工艺可以为今后SOD的纯化工艺研究和工业化生产提供科学、可靠的技术指导.     

高产蛹虫草诱变菌株发酵条件优化及放大

考察高产蛹虫草诱变菌株放大发酵条件,为产业化奠定实验基础。以蛹虫草菌丝体干重、多糖、腺苷和虫草酸质量浓度为指标,采用单因素试验的方法优化5 L发酵罐发酵条件:搅拌转速、发酵培养基初始pH值和接种量,并在此条件下重复4次实验,以考察发酵条件的稳定性;进一步考察15 L和100 L发酵罐发酵条件。5 L发酵罐发酵条件为:转速250 r/min、起始pH值7、接种体积分数6%,发酵温度26℃,通气量250 L/h,菌丝体干重、多糖、腺苷和虫草酸质量浓度分别达到23.29 g/L、0.94 g/L、162.84 mg/L和2.06 g/L,4次重复实验发酵条件稳定(P0.01)。15 L发酵罐的最佳发酵时间为72 h,菌丝体干重、多糖、腺苷和虫草酸质量浓度分别达到30.84g/L、1.10 g/L、233.22 mg/L和1.89 g/L;100 L发酵罐的最佳发酵时间为47 h,菌丝体干重、多糖、腺苷和虫草酸质量浓度分别达到32.05 g/L、1.33 g/L、187.20 mg/L和3.51 g/L。5 L发酵罐发酵条件稳定,以菌丝体干重、多糖、腺苷和虫草酸质量浓度为综合考察指标,分别绘制了高产蛹虫草诱变菌株15 L、100 L发酵罐发酵生长曲线,为生产提供了数据依据。     

产琼胶酶菌株NBRC102603发酵条件优化及酶的分离纯化

通过正交试验对产琼胶酶海洋菌株NBRC102603发酵条件进行了优化,优化得到的发酵产酶条件为:蛋白胨浓度5.0 g/L、酵母膏浓度1.25 g/L、琼胶浓度4.0 g/L、装瓶量100 mL、接种量1%、转速150 r/min,28℃下发酵48 h后酶活力达到58.94 U/mL,比未优化前提高了2.08倍。经纯化得到琼胶酶A和琼胶酶B,琼胶酶A纯化倍数为17.29倍,酶比活力为870.51 U/mg;琼胶酶B纯化倍数为16.65倍,酶比活力为838.39 U/mg。纯化后琼胶酶经SDS-PAGE检测,显示为单一条带,其相对分子质量酶A约为83.6 ku、酶B约为36.8 ku。     

干酪乳杆菌LCR6013中NiR和电子供体的分离纯化及其协同降解亚硝酸盐

干酪乳杆菌LCR 6013经10.00 mg/L的亚硝酸钠诱导和溶菌酶破壁,粗酶溶液分别经过30%和60%饱和硫酸铵溶液分级沉淀,沉淀被溶解和透析后分别得蛋白液Ⅰ和蛋白液Ⅱ,通过阴离子DEAE Sepharose Fast Flow和葡聚糖凝胶G-100层析柱分离纯化。蛋白液Ⅱ纯化得亚硝酸盐还原酶蛋白(NiR),在加入细胞色素C才能降解亚硝酸盐,LCR6013的每升发酵液得到0.54 mg活性酶蛋白,其NiR比酶活为1851.20 U/mg,得率为2.08%,纯化后其NiR比活力提高16倍,经SDS-PAGE电泳确定LCR6013 NiR的单体分子质量约为45 ku。同时,由蛋白液Ⅰ纯化的蛋白加入LCR6013的NiR中,表现降解亚硝酸盐的活力,经鉴定为电子供体蛋白(El D),经SDS-PAGE电泳确定LCR6013中ElD的单体分子质量约为13 ku,与细胞色素C的单体分子质量相同。LCR6013的ElD、细胞色素C、FeSO_4和Na_2SO_3分别协同NiR能在48 h内将75.00 mg/L的亚硝酸钠完全降解,而LCR6013的ElD和细胞色素C降解效果最好。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子质量,并对其酶学性质进行研究。结果表明,经分离纯化后得到分子质量约为116 kDa的β-葡萄糖苷酶,纯化倍数达到50.39倍,回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg,该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为5.0,在温度30～50 ℃,pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性。     

1 株广谱抗菌活性菌株的筛选鉴定及其抗菌蛋白的分离纯化

从湖南传统腊肉中分离筛选得到1 株具有广谱抑菌活性的菌株HLR13,该菌株发酵液对蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、藤黄微球菌和肠炎沙门菌等食品中常见的致病菌具有较强的抑制活性。通过形态学特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种（Bacillus subtilis subsp. spizienii）。采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析（Q Sepharose FF）和凝胶过滤层析（Sephadex G-75）等方法对该菌株所产抗菌蛋白进行分离纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示纯化后的蛋白为单一条带,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析和NCBI/nr蛋白数据库比对初步确定该抗菌蛋白分子质量为31?494?Da,是枯草芽孢杆菌产生的一种假定蛋白。本实验可为新型天然防腐剂的开发提供一定理论依据。     

内生多黏类芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其体外溶栓作用

植物内生菌株 EJS-3 发酵液经离心除菌,硫酸铵分级沉淀,Hiprep phenyl FF 疏水层析,RESOURCEM Q离子交换层析和Sephacryl S-300HR 凝胶过滤,获得电泳纯的多黏芽孢杆菌纤溶酶(PPFE-I),聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量为63kD,高效液相色谱法(HPLC)鉴定其纯度为94.1%。每升发酵液中可获得1.6mg 活性蛋白,每毫克蛋白活力达2096IU,纯度提高了14.5 倍,回收率为3.3%。纯化后的纤溶酶PPFE-I 具有明显的体外溶栓作用。     

Two-step chromatographic procedure for the preparation of hen egg white ovotransferrin

 A two-step chromatographic procedure for the preparation of hen egg white ovotransferrin by using an anion exchanger is described. The method consists of a preliminary step of frontal chromatography, also called displacement chromatography, on a Q Sepharose Fast Flow column. This simple and powerful chromatographic step enables the pre-purification of ovotransferrin that is further purified by a second conventional preparative chromatography performed on the same Q Sepharose FF column. The ovotransferrin obtained is found to be homogeneous in electrophoresis and analytical chromatography. Its purity rate is calculated at 97.5% and its amino acid composition is close to that obtained from the nucleotide sequence of ovotransferrin. Moreover, ovotransferrin is iron-free, thus suitable for studies in relation to its metal-binding activity. Received: 31 March 2000 / Revised version: 29 May 2000     

A lectin from the rhizomes of turmeric (Curcuma longa L.) and its antifungal, antibacterial, and α-glucosidase inhibitory activities

A Curcuma longa L. lectin was purified by aqueous extraction, 80% ammonium sulfate precipitation and ConA Sepharose affinity chromatography. Its specific activity was of 64,566 HU/mg protein for a yield of 41.2% total protein. The molecular weight is of 17.3 kDa. It has hemagglutinating activity against human blood group B, rabbit, mouse, rat, guinea pig, geese, and sheep erythrocytes. The optimum pH is between 6–7, and stable up to 40°C. Activity was stimulated by Ca²⁺ and Mn²⁺. The internal sequence indicated similarity with legume lectin family. Moreover, at concentration of 47 and 94 mg/0.3 cm² disc showed antifungal activity against Exserohilum turicicum, Fusarium oxysporum, and Colectrotrichum cassiicola. The minimal inhibitory concentration were 0.002, 0.005, 0.011, 0.09, and 0.046 mg/mL Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escheriehia coli, and Candida albicans, respectively. Additionally, it contains a high α-glucosidase inhibitory activity with an IC₅₀ of 8 mg/mL.     

产云芝胞外多糖发酵工艺优化及抗氧化活性研究

试验对云芝发酵生产胞外多糖的培养基进行优化并对其抗氧化活性进行研究,通过单因素试验和中心组合设计并用Design-Expert 7.0软件对实验结果进行分析,确定培养最优条件为氮源5.870 g/L多价胨,碳源53.120 g/L麦芽糖,起始pH值为5,温度28℃,搅拌发酵转速150r/min,多糖得率为10.098 2 g/L;对发酵多糖进行提取分离和脱蛋白处理得到EPS,然后用邻二氮菲法和DPPH法测定了EPS的抗氧化活性,结果表明,EPS对·OH自由基和DPPH·自由基均具有较高的清除率,且具有较好的量效关系,说明云芝EPS具有较强的抗氧化活性.     

苦荞麦抗肿瘤蛋白的分离纯化及结构分析

本研究采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换色谱、Sephadex G-100凝胶过滤色谱和SephacrylS-200凝胶过滤色谱对苦荞麦水溶性蛋白质(TBWSP)逐步分离纯化,并结合细胞实验,筛选出苦荞麦水溶性蛋白质中体外抗肿瘤活性的有效组分TBWSP31。体外抗肿瘤活性实验表明,TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37细胞有明显的增殖抑制作用,并且存在时间效应和剂量效应。SDS-PAGE表明,TBWSP31为单一组分,其亚基的相对分子质量为57000。CD分析表明,TBWSP31的α-螺旋的含量为33.9%,β-折叠的含量为22.8%,β-转角的含量为11.3%,无规卷曲的含量为32.0%。     

海洋胶红酵母菌CD-008产超氧化物歧化酶发酵条件优化及酶分离纯化

在单因素试验基础上,结合Plackett-Burman、Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析以确定海洋胶红酵母菌Rhodotorula sp. CD-008产超氧化物歧化酶最佳发酵条件,并通过盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析研究了酶的分离纯化条件。结果表明,pH、转速、温度对酶活力有显著影响,最优发酵条件为pH 5.34、转速150 r/min、温度21.40 ℃,优化后发酵液酶活力达到6 430.52 U/g湿菌体,比优化前提高了1.53倍。粗酶液经65%饱和度的硫酸铵盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析后获得的SOD比酶活达到419.90 U/mg,纯化倍数为9.60倍,蛋白回收率为8.2%。SDS-PAGE凝胶电泳显示,纯化后的SOD的分子质量约为37.5 ku。